In vivo serebral mikrodiyaliz ile kuvvet ve rotasyonu birleştiren bir yeni ve translasyonel rat modeli

Bu yöntem, araştırmacılara, sarsıntının moleküler etkilerinin uzunlamasına karakterizasyonuna olanak sağlayan güvenilir ve çevirisel bir beyin sarsıntısı modeli sunarak gelecekteki çalışmalar için bir paradigma oluşturur. Bu sıçan modeli insan kraniyoserebral travmanın önemli bir özelliği taklit baş ve gövde hızlı ivme ve yavaşlama uygulayan bir kama şal tekniği ile sürekli analit nicel izin mikrodiyaliz birleştirir. Bu tekniğin etkisi, farmakolojik ajanların mekanizmasını ve etkinliğini in vivo ve kesintisiz olarak incelemek için değerli bir fırsat sunduğundan, beyin sarsıntısının terapötik çalışmalarına kadar uzanır.

Manipülasyon hatalarını kısıtlamak ve deneme sırasında verimliliği en üst düzeye çıkarmak için bu yöntemin sarsıntı ve sahte indüksiyon adımları sırasında iki takım halinde çalışmak şiddetle tavsiye edilir. Prosedürü gösteren Chloe Provost, laboratuarımızda bir teknisyen olacak. İşleme başlamak için, elektrikli bir makas kullanarak hayvanın kafasını tıraş edin.

Tıraş alanını %2 oranında isopropil alkol ve %2 klorheksidin glukonat çözeltisi kullanarak üç kez temizleyin. Daha sonra anestezi sırasında kuruluk önlemek için yağlama göz merhemuygulayın. Sonra, bir stereotaksik cihaz içinde sıçan yerleştirin.

Kulak çubuklarını kulak kanallarına büyük bir özenle takın ve burun kıskacını sıkın. Daha sonra, stereotaksik cihaz üzerinde tutucu kol için 26 gauge paslanmaz çelik kılavuz kanül düzeltmek. Kafa derisi üzerinde üç santimetre lik bir orta hat kesiği yapın.

Kesiğin etrafına dört kelepçe takarak kafatasını temize çıkar. Bregma ve lambda dikişleri görülene kadar periyosiyi cerrahi bıçakla kafatasından sıkıca kazıyın. Kanama varsa, bir gazlı bez ped veya pamuk uçlu aplikatör ile kafatası üzerinde sıkı basınç koruyun.

Kafatasının stereotaksik cihazüzerinde bregma ve lambda dikişlerinin dorsoventral koordinatlarını karşılaştırarak doğru bir şekilde hizalanıp hizalanarak doğrulanın. Kılavuz kanülünün koordinatları için referans noktaları olarak bregma sütürünün anteroposterior, mediolateral ve dorsoventral koordinatlarını tanımlayın. Daha sonra referans olarak bregma dikiş koordinatları alarak, hipokampus rehber kanül implantasyon sitenin koordinatlarını hesaplamak.

Kesin implantasyon bölgesini bir işaretleyici kullanarak işaretleyin. Daha sonra, kılavuz kanül hedef yerinde kafatası ile 0,5 milimetre çapında bir delik matkap. Bu noktanın etrafında yaklaşık beş milimetre lik diğer üç deliği delerek, akrilik diş çimentosu uygulandıktan sonra kanülkatı olacak kafatasına üç çapa vidası geçirin.

Sonra, hipokampus içine kanül ekleyin ve diş çimentosu ile düzeltmek. Ağırlığın bırakılacak sitenin etrafına fazla diş çimentosu dökmemeye dikkat edin. Çimento iki dakika kurumaya bırakın sonra kanül tutucu kol çıkarın.

Beyin omurilik sıvısı sızıntısı ve enfeksiyon risklerini önlemek için kanül içine paslanmaz çelik çıkarılabilir obturator yerleştirin. Daha sonra, dört kelepçeleri çıkarın, geri çekilen deriyi geri çekin ve cerrahi bir dikiş ipliği ile dikin. Daha sonra, cihazdan sıçan çıkarın ve ağrı tedavisi için deri altı Buprenorfin enjekte.

Kemirgeni, bilinci bitene kadar altında bir ısıtma yastığı ile kafesine geri yerleştirin. Daha sonra yakın izleme altında yedi günlük bir iyileşme süresi için hayvan bakım tesisine geri dönün. Bu işlemde, kanülden obturator çıkarın ve yavaş yavaş bir mikrodiyaliz probu ekleyin.

Daha sonra, sonda montajını sıvı bir dönere bağlanmış paslanmaz çelik bir yay ve bir halka standı ve kelepçelerle denge koluna sabitleyin, böylece hayvan kafesinde serbestçe hareket edebilir. Bağlı sıçanlar tüm mikrodiyaliz prosedürü sırasında yiyecek ve suya reklam libitum erişimi ne var. Prob perfusate teslim etmek ve erimiş silika çıkış hattından dialysate toplamak için bir mikroinfüzyon pompası kullanın.

İşlembaşlamadan en az bir saat 30 dakika önce, sondayı dakikada bir mikrolitre hızında çalışma akış hızına çevirin. Sondanın akış hızının, bir pipetle zaman içinde hacmi ölçerek tutarlı olduğunu doğrulayın. Daha sonra, analit bozulmasını önlemek için litre perklorik asit başına 0,25 mol bir mikrolitre ile önceden yüklenmiş bir fraksiyonşişe her dialysate örnek toplamak.

Sonraki analiz için numuneyi dört santigrat derecede saklayın. Son numune toplandıktan sonra, mikrodiyaliz probu ndan kanülden çıkarın ve fareyi hayvan bakım tesisine geri vermeden önce obturator'u yeniden yerleştirin. Sarsıntı aparatı yüklemek için, bir köpük yastık içeren U şeklindepleksi çerçeve sıkıca bir alüminyum levha bant.

Alüminyum levha da yarım kusmama yapmak için keskin bir jilet kullanın. Oluklu alüminyum levha bant. Ardından pleksiglas çerçeveyi PVC kılavuz tüpün altına yerleştirin.

PVC kılavuz tüpünü, oluklu alüminyumun 3-1/2 santimetre üzerinde bir kelepçe standı ile yerinde tutun. Ağırlığın alt oluklu alüminyum üzerinde 2-1/2 santimetre olduğu için metal döngü ile bir naylon sinek olta takın sıçan darbe sonrasında köpük yastık üzerine düşüyor birden fazla isabet önlemek için. Sonra naylon sinek oltasını kelepçe standına takın.

Naylon sinek olta ile PVC tüp üzerinden ağırlık çekin. Oluklu alüminyum folyo üzerinde bir metre ön delinmiş delikler aracılığıyla bir hex anahtarı takarak yerinde tutun. Beyin sarsıntısı nı tetiklemek için, hayvanı göğsüne oluklu alüminyum levha üzerine yerleştirin, böylece kafası doğrudan pirinç ağırlığının yoluna yerleştirilecektir.

Burun koni çıkarın ve hex tuşunu çekin. Ağırlık PVC tüp üzerinden dikey düşecek ve sıçan başını etkisi. Sonuç olarak, sıçan hızlı bir 180 derece rotasyon geçirecek ve sırtına arazi.

Köpük yastık sıçan çıkarın ve kafeste sırtına yerleştirin. Kurtarma ve yaralanma şiddeti bir işareti olarak doğru refleks süresini ölçmek için bir dijital zamanlayıcı kullanın. Sağrefleks süresi sıçan uyanır ve kendiliğinden eğilimli konumuna döner veya yürümeye başlayana kadar darbe toplam süre.

Herhangi bir ölüm, kırık veya kanama belirtisi ne olursa olsun. Sham indüksiyon için, başını pirinç ağırlık yolunda doğrudan yatıyor, böylece oluklu alüminyum levha üzerine göğsüne hayvan yerleştirin. Burun koni çıkarın ve sonra hex tuşuna çekmeden alüminyum levha hayvan çıkarın.

Daha sonra, kafeste sırt Üzerinde sıçan yerleştirin. Nörolojik restorasyonun bir göstergesi olarak doğru zamanı ölçmek için dijital zamanlayıcı kullanın. Yaralı gruptan hayvanlar, sahte vakalara karşı ortalama olarak önemli ölçüde daha fazla düzeltme süresine sahipti ve bilincini niçin geri kazandıktan sonra sersemlemiş görünüyordu.

Beyin sarsıntısı grubundaki 10 vakadan sadece bir hayvanı, kilo damlasının ardından darbe bölgesinin altında küçük kanama belirtileri gösterdi. Travma indüksiyonunu takip eden ilk 10 dakika boyunca hipokampal CA1 bölgesinde ekstrasellüler glutamat konsantrasyonlarında sham yaralanmaya göre anlamlı artışlar gözlendi. Bu bir beyin sarsıntısı daha önemli ölçüde daha şiddetli sıçan çekirdeğinde yaralanmalar ayar gibi beyin sarsıntısı indüksiyon sırasında ağırlığı ile kanül etkileyen önlemek unutmayın.

Prosedür farklı zaman noktalarında aynı hayvanlar üzerinde tekrarlanabilir yakın bir kafa yaralanması olduğundan bu yöntem tekrarlanan beyin sarsıntıları çalışmaya uygulanabilir.