Mercan Kolonilerinde Polip Kefalinin Laboratuvar Deneysel Kullanımı için Bireyselleştirilmiş Mikropropagatlar Elde Edilmesini İndüklemek

Mercan mikropropagasyonu hala emekleme aşamasındadır. Polip kurtarma için protokollerin optimize edilmesi, bilim adamlarının laboratuvar ortamlarında mercanları incelemek için polipleri model olarak kullanmalarına izin veren bu boşluğu doldurmanın anahtarıdır. Polip kurtarma paketi, küçük mercan parçalarından çoklu yayılımlar oluşturmayı mümkün kılar.

Polipler, örneğin mercanlardaki mikroskobik işlemlerin gözlemlenmesini kolaylaştıran farklı deneylerde kullanılabilir. Mercan resifleri tehdit altındadır. Amacımız, mercanları ağartma ve diğer çevresel tehditlerden etkili ve invaziv olmayan bir şekilde korumak için stratejiler geliştirmek için bu tekrarlanabilir modeli kullanmaktır.

Bu yöntem, mercan fizyolojisinin, konakçı mikrobiyom etkileşimlerinin ve beyazlatmada rol oynayan mekanizmaların araştırılmasına yardımcı olabilir. Bu bulgular, örneğin mercan probiyotiklerinin optimizasyonuna katkıda bulunabilir. Deniz suyunu yeterli tuzlulukta kullanmak anahtardır.

Tuzluluk, mercanın doğal ortamı seviyesinde başlamalı ve stresin aşırı zararlı olmaması için yavaşça artmalıdır. Polipleri doğru zamanda toplamak ve en sağlam olanları seçmek, hayatta kalmaları için çok önemlidir. Görsel bir gösterim, bu ipuçlarını anlamak için hayati önem taşıyabilir.

İlk olarak, bir mercan kolonisinden küçük parçaları kesmek için çapraz kesme penseleri kullanın, daha sonra bunları mercan kolonisinin iklimlendirildiği 12 mililitre deniz suyuyla dolu küçük Petri kaplarına yerleştirin. Plakayı ortam sıcaklığında yaklaşık 24 saat açık bırakın, böylece su buharlaşır ve tuzluluğu yavaş yavaş artar. Polipler arasında doku sindirimi gözlemlenebilir olduğunda, mercan dokusuna yakın yumuşak bir akış oluşturmak için 1 mililitrelik bir transfer pipeti kullanın.

Akış, etraflarındaki dokuyu iskeletten zaten sindirmiş olan poliplerin ayrılmasını yavaşça tamamlamaya yardımcı olacak, daha sonra pipetle, Petri kabındaki suyu izosmotik suyla yavaşça değiştirecektir. Yüksek tuzlulukta deniz suyu hazırlamak için, normal deniz suyunu alın ve tuzluluk% 85 oranında artana kadar üç litre yüksek tuzluluklu deniz suyu hazırlamak için deniz suyuna sodyum klorür ekleyinDaha önce gösterildiği gibi küçük mercan parçalarını kestikten sonra, peristaltik bir pompaya bağlı üç litre izosmotik deniz suyu içeren 10 litrelik bir kaba koyun. Bu kabı, tuzluluğu yaklaşık% 40 oranında artırmak için saatte 126 mililitre oranında 24 saat boyunca önceden hazırlanmış üç litre yüksek tuzluluklu deniz suyuyla doldurun Bir pipet kullanarak, polipleri iskeletten serbest bırakmak için yumuşak bir su akışı oluşturun.

Kaptaki suyu yavaşça izosmotik deniz suyuyla değiştirin. Kalsiyumsuz deniz suyu hazırlamak için bir litre deiyonize suya 26.29 gram sodyum klorür, 0.872 gram potasyum klorür, 2.16 gram magnezyum sülfat, 11.94 gram magnezyum klorür, 3.42 gram sodyum sülfat ve 0.26 gram sodyum bikarbonat ekleyin, ardından Petri kaplarını bu kalsiyum içermeyen deniz suyuyla doldurun. Küçük mercan parçalarını kestikten sonra, Petri kaplarında kalsiyum içermeyen deniz suyuna batırın.

Bulaşıkları 80 rpm'lik bir dönme hızında üç saat boyunca bir yörüngesel inkübatöre koyun, ardından parçaları, 40 pratik tuzluluk ünitesinin yapay deniz suyuyla hazırlanan ve litre ampisilin başına 100 miligram içeren% 20 DMEM ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın. Parçaları 26 santigrat derece ve 80 rpm'de inkübe edin. Polipler arasında doku sindirimi gözlemlenene kadar her gün medyayı değiştirin ve bireysel polipler iskeletten ayrılmaya başlar, daha sonra polipleri sterilize edilmiş deniz suyuna aktarın ve bir saat boyunca inkübe edin.

Polipler stressiz tuzluluk ile filtrelenmiş deniz suyuna geri döndükten sonra, stereo mikroskop altında siliyer akışın neden olduğu doku bütünlüğünü ve hareketini gözlemleyerek canlı polipleri seçin. Seçilen polipleri bir Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını 200 mikrometre ağ boyutunda bir plankton ağ ile örtün, böylece polipler çanaktan uzaklaşmaz. Petri kabını, kullanılan mercan türleri için uygun koşullara sahip bir akvaryumun içine yerleştirin.

Alglerin aşırı büyümesini önlemek için, suyu yenilemek ve kabı temizlemek için Petri kabını haftada en az bir kez açın. Polipleri daha önce gösterildiği gibi seçtikten sonra, bir transfer pipeti kullanarak, bunları 50 mililitre izosmotik deniz suyuyla doldurulmuş 75 santimetrekarelik bir yüzey hücresi şişesine yerleştirin, ardından şişeyi kapatın ve 12 saatlik ışık döngüsü, 26 santigrat derece ve 40 rpm'de ayarlanmış bir inkübatöre koyun. Şişe yosun veya biyofilmlerle doldurulursa, içeriği temiz bir şişeye aktarın.

Bu çalışmada polip kurtarma üç farklı yöntemle tetiklenmiştir. Su buharlaştırma yöntemi, inkübasyondan sonraki 24 saat içinde tam bir kurtarma ile sonuçlandı ve tuzluluk, 24 saat sonra 40'tan 59 pratik tuzluluk ünitesine yükseldi. Tuzlu su temini yöntemi ayrıca 24 saatlik inkübasyondan sonra polip kurtarma ile sonuçlandı.

Burada, tuzluluk, 12 saatlik inkübasyondan sonra 40'tan 52 pratik tuzluluk birimine ve daha sonra 24 saat sonra 59 pratik tuzluluk birimine yükselmiştir. Kalsiyumsuz deniz suyunda inkübasyon yoluyla kurtarma indüksiyonu, içindeki poliplerin üç saatlik inkübasyonundan sonra tamamlandı, ardından% 20 DMEM ortamında 20 saatlik inkübasyon, Her üç yöntemde de bireyselleştirilmiş mercan polipleri üretilebildi. Buharlaşma yöntemiyle üretilen mercan polipleri altı hafta boyunca hayatta kalabilirken, yüksek tuzlulukta deniz suyu temini yöntemiyle üretilenler akvaryumların içindeki Petri yemeklerinde sekiz hafta boyunca hayatta kalabilir.

İnkübatörlerin içindeki hücre kültürü şişelerinde tutulan deniz suyu buharlaştırma yönteminden elde edilen polipler, dokularının tamamen ayrışması olmadan üç haftaya kadar hayatta kalmıştır. Polipleri iskeletten ayırırken, nazik olmak önemlidir. Tamamen ayrılmamışlarsa, suyu kuvvetli bir şekilde pipetleyerek ayrılmaya zorlamak hasara ve daha düşük hayatta kalma oranlarına neden olacaktır.

Bu yöntemler kullanılarak, poliplerin yerleşmesi indüklenebilir. Poliplerin yerleşimi, kalsifikasyonu ve büyüme süreçleri hakkındaki soruları cevaplayabilir. Polip kurtarma indüksiyonunun geliştirilmesinden sonra, araştırmacılar mercan iskeletinin ilk oluşumunu inceleyebildiler ve polip ölçeğinde mercan ağartmasını doğrudan görselleştirebildiler.