Modlu Optik Mikroskopi Yöntemleri Caribbean Reef Yapı Mercanlar içinde Polip Doku Morfoloji ve Yapı Göstermektedir

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ince yapının yanı sıra mercan pigmentlerini ve lokalizasyonlarını anlamak için bir ila iki milimetre kalınlığındaki mercan poliplerini 3D olarak görüntülemektir. Bu, önce numunenin balmumu içine gömülmesi, ardından numunenin bir mikrotom kullanılarak bir mikronluk bölümler halinde kesilmesiyle elde edilir. Daha sonra, mercan poliplerini görüntülemek ve 3D görüntüyü yeniden oluşturmak için özel olarak tasarlanmış bir seri blok yüz tekniği kullanılır.

Birden fazla 2D görüntü kullanılarak, tekniğin mercan dokusunun ince yapısal detaylarını yapısal bütünlüğünden ödün vermeden çözme yeteneğini gösteren sonuçlar elde edilir. Prosedürün gösterilmesi. Bugün, araştırma grubumla işbirlikçi olan Dr.Maunde Siva gurusu olacak.

Ön filtrasyon balmumu hazırlamak için, 3.6 gram direksiyonu pullar halinde eritin, sıcak bir plaka üzerinde bir cam beherde. Sonra, 400 miligram Sudan ekleyin. Balmumu arka plan floresansını en aza indirmek için dört, iyice karıştırın ve kırmızı yarı saydam bir çözelti elde edilene kadar bekleyin.

Sonra 81 gram parafin ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, 15 gram beyaz granül VI bar ekleyin ve aynı beherde tamamen eritin. Eridikten sonra, tamamen karışık bir balmumu çözeltisi elde etmek için tekrar karıştırın.

Şimdi karışımı bir cam şişeye ekleyin ve bir kapakla gevşek bir şekilde kapatın. Malzemeleri sıvı halde tutmak ve tüm sızmaların gerçekleşmesi için cam şişeyi 60 santigrat derece konveksiyonlu fırına yerleştirin. Bu çözelti 200 mililitreye kadar yapılabilir ve iki adet 100 mililitrelik şişeye bölünebilir.

Biri sızma için, diğeri ise son gömme için Karayip resif binası mercan örnekleri AU'dan toplandı ve sahada para formaldehit içine sabitlendi. Mercan dokularını SBFI için gömmek için, önce tarlada toplanan mercan poliplerini yıkayın ve bunları dört santigrat derecede para formaldehitte saklayın. Daha sonra, görüntülenmeye hazır olduklarında her seferinde beş dakika boyunca PB S3'te yıkayın.

Polipleri ex Cal iki solüsyonunda 24 saat boyunca veya polipler tamamen kalsiyum karbonattan yoksun olana kadar kireçten arındırın. Birkaç kalsifiye edilmiş mercan polipini %25, 50, 75 ve 100 etanol serisinde tek bir blok olarak inkübe edin ve ardından bir x ksilen ekleyin. Numuneleri kurutmak için her seansta 30 dakika değiştirin.

Daha sonra işlenmiş polipleri% 100 ksilen içine yerleştirin. 65 derecelik bir fırında 30 dakika boyunca değiştirin. Daha sonra taze çözelti ile değiştirin ve 30 dakika daha inkübe edin.

Polipleri üst kısımları aşağı bakacak ve yüzeyi mümkün olduğunca düz olacak şekilde yönlendirin. İkiye bir, bire bir ve bire iki çözümler yapın. Ksilen ikamesi ve ön filtrasyon balmumu.

50 mililitrelik Falcon tüpleri, mercan poliplerini bu üç artan konsantrasyonda ön filtrasyon mumu ile inkübe eder, ardından her seferinde 30 dakika ila bir saat boyunca% 100 Ön filtrasyon balmumu içinde üç inkübasyon yapar. Şimdi numuneyi gömme mumuna aktarın. Gömme balmumu 30 dakika sonra çıkarın, ardından yeni gömme balmumu ile değiştirin ve inkübasyona 65 santigrat derecede en az dört saat devam edin.

Daha sonra bloğun fotoğrafını çekin. Bu gereklidir, çünkü balmumuna bir kez gömüldükten sonra, gömülen kırmızı balmumu opak olduğu için numunenin konumu görünmez hale gelecektir. Ardından, yeni önceden ısıtılmış paslanmaz çelik gömme kalıbının etrafına küçük damlalar halinde yüksek erime noktalı balmumu yerleştirin ve soğumaya bırakın.

İkinci alikottan küçük bir hacimde taze eritilmiş ve yatak cilası dökün ve mercan polipini beyaz balmumu noktasının üzerine hızlı bir şekilde aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra paslanmaz çelik tepsiye plastik bir numune tutucu yerleştirin ve balmumu plastik kalıbın yüzeyine gelecek şekilde daha fazla gömme balmumu dökün. Şimdi tüm kurulumu 65 derecelik fırından çıkarın ve balmumu tamamen sertleşene kadar bir tezgahta veya serin bir yüzeyde soğumaya bırakın.

Bundan sonra, kurutulmuş bloğu, bloğu bölümlere ayırmak için uzun süreli saklama için ışıktan korunan dört santigrat derecede bir buzdolabına yerleştirin. İlk önce kesin ve bir mikronluk bölümler kesin. Bir mikrotom kullanarak, numuneyi içeren pürüzsüz blok yüzünün görüntüsünü yakalayın.

her zaman. Bir bölüm çıkarıldığında, beyaz balmumu kaybolmaya başladığında numune görünür. Ardından, kromatoforların veya mercan polip görüntüsünün otofloresansını almak için uygun bir floresan filtre kullanarak, her numuneden üç ila dört kireçten arındırılmış çekirdek olan görüntüleri tek renkli bir kamerayla yakalayın.

İki foton floresan görüntüleme gerçekleştirmek için, yıkanmış mercan polip çekirdeklerini, 10 x objektif kullanarak iki farklı büyütmede üç ila dört polipte 780 nanometre uyarma görüntüsünde iki foton lazer kullanarak kapalı bir cam alt tabağa baş aşağı% 4 para formaldehit içine yerleştirin. Ardından, XY'de 10 veya 20 mikron aralıklarla odak düzlemi başına yaklaşık 25 ila 100 görüntü toplamak için döşeme tarama modunu kullanın. Daha sonra Z ekseni boyunca 10 veya 20 mikron aralıklarla 50 ila 100 görüntü toplayın, bu da mercan polipi başına toplam 5.000 ila 10.000 görüntü olacaktır.

Bu görüntüden sonra, bir çekirdek ve mercan türünü temsil etmek için üç ila dört polip alanı. Ardından tüm görüntüleri ham veri biçiminde sistemin sabit diskinde saklayın. Bu prosedürde, kare kırpma aracını kullanarak tek bir polip üzerine odaklanarak dosya boyutunu küçültmek için 2B verileri kırpın ve tek bir TIF dosyası olarak derleyin.

Satın alma yazılımında. SBFI verilerinin birleştirilmiş dosyalarını veya iki foton optik bölümünün döşenmiş çoklu Z yığınlarını, hacim algoritması projesi altında EMERIS geçiş programı modülünde, SBFI verileri 3D olarak işlenir. Bir gölge projeksiyonu kullanarak, katı bir yüzey deseni oluşturmak için voksellerin eşik olduğu bir ISOSURFACE modu oluşturun.

Mercanların 3B yapısını ve şeklini ortaya çıkarmak için XY, xz ve YZ ortogonal modlarında bir kırpma düz algoritması kullanarak 3B projeksiyonları görselleştirin. Ardından, bir ana kare animasyon modülü kullanarak projeksiyonları canlandırın. Aynı erris programında,% 5 sıkıştırmada video dosyaları oluşturun ve hacim 3D ve izoyüzey modalitelerini kullanarak VI formatında film klipleri oluşturun.

İşte M Anis ve M fa Lata'dan mercan poliplerinin iki foton floresan 3D görüntüsü. Bu iki görüntü, 450 ila 700 nanometre arasında toplanan optik sinyal ile iki foton lazerin 780 nanometre uyarımı kullanılarak bileşenlerin spektral ayrımı yapılmadan yakalandı ve bu iki görüntü aynı uyarma ile toplandı, ancak iki bileşenden veri toplamak için aynı anda iki foto çoğaltıcı tüp dedektörü kullanıldı, biri 500 ila 550 nanometre ve diğeri 650 ila 720 nanometre. Bunlar derinlik kaplamalı görüntülerdir.

Kırmızı en sığ olanlardır ve mavi, 2D'deki en derin bileşenlerdir. evet. Bu prosedürü denerken, kırmızı mum gömülü numuneyi uygun şekilde hazırlamayı unutmamak önemlidir. Seri blok yüz görüntüleme ve floresan mikroskobu üzerinde iki ayağın kombinasyonu, çeşitli lens ölçeklerinde mercan pigmentasyonu ve hücresel yapının analizine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, resif bina mercanlarının ve spektral özelliklerinin üç boyutlu olarak nasıl ele alınacağını ve görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.