Polikaprolakton İskelelerinin ve hiPSC'den Türetilmiş Kardiyak Hücrelerin Eriyik Elektrospinning Yazımı Kullanılarak 3D İnsan Miyokard Dokusu Üretimi

Eriyik elektrospinning yazma (MEW), polikaprolakton (PCL) iskeleleri ve fibrin hidrojelleri hiPSC türevi kardiyomiyositler ve fibroblastlarla birleştiren 3D miyokardiyal dokular oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Bu teknik, iskele mimarisi üzerinde hassas kontrol sağlar ve klinik öncesi ilaç testlerinde ve kalp hastalığı modellemesinde uygulanabilir.

Bu çalışma, hastalık modellemesi, ilaç testi ve rejeneratif tıp uygulamalarını iyileştirmek için eriyik elektrikli iskele ve insan iPSC türevi kalp hücreleri kullanılarak biyometrik 3 boyutlu kardiyak dokular geliştirmeyi amaçlamaktadır. Kök hücre kardiyomiyositlerinde insan kaynaklı rapor olgunlaşmamış kalır ve işlevselliklerini sınırlar. Ek olarak, kalp dokusunu 3D olarak modellemek için gereken ciddi karmaşıklığı yeniden üretmek zordur.

Bu model, doğal miyokard'ı daha iyi taklit ederek hastalık modellemesi, ilaç testi ve hastaya özel uygulamalar için karmaşık 3D hücre dışı matris etkileşimlerini mümkün kılar. 2B kültürlere ve hayvan modellerine daha uygun bir alternatif sunar. İleriye dönük olarak, araştırmamız kardiyomikoloji modellerini araştırmaya, 3D doku olgunlaşma protokollerini geliştirmeye ve domuzlar gibi büyük hayvan modellerinde klinik öncesi miyokard enfarktüsü tedavileri için daha büyük yapılar geliştirmeye odaklanacaktır.

Başlamak için, şırıngayı basınçlı bir nitrojen besleme borusuna bağlayın ve ısıtma odasının içine yerleştirin. Eriyik elektrospinning yazma ekipmanını açın ve sıcaklık regülatörlerini hazne için 80 santigrat dereceye ve nozul için 65 santigrat dereceye ayarlayın. 30 dakika sonra, yazıcı kafası plakanın bir kenarına veya istenen herhangi bir yere yerleştirilene kadar kolektör plakasını hareket ettirin.

Isıtma odası ile kolektör plakası arasındaki mesafeyi z düzleminde manuel olarak 10 milimetreye ayarlayın. Elektrik alan beslemesini otomatik olarak bağlayan ekipmanın kapısını kapatın. 23 gauge uçtan ekstrüzyon için voltajı nitrojen basıncında yedi kilovolta, iki bara ayarlayın.

Kare desen geometrisine sahip iskeleleri yazdırmak için tasarım G Kodunu yazılıma yükleyin. Kollektör hızını dakikada 1080 milimetreye ayarlayın. Ardından yazdırmayı başlatmak için Döngü Başlat düğmesine basın.

Yazdırma bittikten sonra, iskeleyi kollektörden dikkatlice çıkarın. Doku üretimi için son iskeleleri elde etmek için altı milimetre çapında bir zımba kullanarak baskılı ağı kesin. İskeleleri beş dakika boyunca oksijen plazması ile tedavi edin.

Ağları 30 dakika boyunca% 70 etanole batırarak sterilize edin. Steril damıtılmış su ile 30 dakika boyunca yoğun bir şekilde yıkayın, ardından kurumaya bırakın. İnsan iPSC kardiyomiyositlerini ayırdıktan sonra, doku oluşturma ortamında hücre peletini yeniden askıya alın ve Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın.

Benzer şekilde, insan iPSC kardiyak fibroblastlarını ayırdıktan sonra, doku oluşturma ortamındaki hücre peletini yeniden askıya alın ve hücreleri sayın. İhtiyaç duyulan toplam hücreleri yeni bir tüpte karıştırın ve içeriğe Hücre Karışımı olarak bakın. Ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin.

Daha sonra hücre karışımını gerekli hacimde doku oluşturma ortamında yeniden askıya alın. Hidrojel Karışımı oluşturmak için, gerekli hacimde fibrinojen tüpe oda sıcaklığında ekleyin ve dikkatlice karıştırın. Fibrinin plakaya yapışmasını önlemek için Hidrojel Karışımını bir politetrafloroetilen yüzeye tohumlayın.

Dokunun hacminin yarısını pipetleyin ve bir damla olarak bırakın. Her damlanın üzerine bir polikaprolakton veya PCL iskelesi yerleştirin ve kalan hacmi iskeleye ekleyin. Şimdi, gerekli miktarda trombin ekleyin ve hidrojeli hızlı bir şekilde karıştırın, kabarcıklardan dikkatlice kaçının.

Fibrin polimerizasyonunu tamamlamak için dokuları 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Steril cımbız kullanarak her bir dokuyu kenarından nazikçe alın ve bunları aprotinin ile takviye edilmiş doku oluşturma ortamı içeren 12 oyuklu plakaya aktarın. Dokuları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, KSR ve Y-27 kalıntılarını gidererek ortamı iki mililitre doku bakım ortamı ile yenileyin. İnsan iPSC kardiyomiyositleri ve insan iPSC kardiyak fibroblastlarının sekiz ila iki karışımının fibrin hidrojellere tohumlanması, polimerizasyondan sonraki bir saat içinde iskele gözenekleri boyunca homojen hücre dağılımı ile sonuçlanır. Konfokal immünofloresan görüntüleri, insan iPSC kardiyomiyositlerinin çoğunluğunun vimentin etiketli insan iPSC kardiyak fibroblastları ile aralıklı sarkomerik aktinin için boyandığı PCL iskelesi ile etkileşime giren 3D doku boyunca hücrelerin karışık bir hücre dağılımını gösterdi.

İnsan iPSC kardiyomiyositleri, düzenli aralıklı sarkomerik aktinin proteini ile iyi organize edilmiş bir sarkomer yapısı sergiler. Hücreler, yedinci günde dakikada ortalama 30 atım frekansı ile ikinci günde kendiliğinden atmaya başladı ve tüm ağ boyunca stabilize kasılma gösterdi. Zaman içinde kademeli bir düşüş gözlendi ve 14. günde 17 BPM'ye ulaştı.

Buna rağmen, metabolik aktivite yedinci gün ile 14. gün arasında sabit kaldı ve bu da hücre canlılığının devam ettiğini doğruladı. Son olarak, atan dokuların iz noktası analizi, saniyede 38 mikrometrelik bir büzülme hızı ve 29 mikrometrelik bir büzülme genliği gösterdi.