Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Bu el yazması, yüzey işaretleyici ekspresyonu ve hücre sıralaması kullanılarak tanımlanmış tasarlanmış kardiyak dokuların oluşturulmasını açıklar. Tanımlanan dokular daha sonra insan kalbinin işlevsel, ancak kontrollü bir model sistemini sağlamak için kardiyak hücre tedavisi mekanizmalarını araştırmak için çok dokulu bir biyoreaktörde kullanılabilir.

Bu prosedürün genel amacı, tanımlanmış bir hücresel bileşime sahip insan mühendisliği kardiyak dokuları oluşturmaktır. Bu yöntem, değişkenlik ve kardiyak farklılaşma verimliliklerinin kontrol edilmesi ve belirli hücre tiplerinin kardiyak kasılma fonksiyonunu nasıl etkilediğini anlamak dahil olmak üzere kardiyak doku mühendisliği alanındaki temel zorlukları ele alabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sonucun kontrollü ve tanımlanmış bir bileşime sahip insan mühendisliği kardiyak dokusu olmasıdır.

Bu tekniğin replikasyonları, kalp hastalığı tedavisine kadar uzanır, çünkü tanımlanmış dokular, terapötik müdahaleleri değerlendirebilen yeni, biyolojik olarak ilgili ve biyomedikal bir tarama platformu sağlayabilir. Bu yöntem yeni kardiyak terapötikler hakkında bilgi sağlayabilse de, insan tarafından tasarlanmış kardiyak doku sistemi, kardiyak hücre tedavisinin mekanizmalarını anlamak için de kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit kültürlerinden başlayarak, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve bir mililitre% 0.04 tripsin-EDTA ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de 10 dakika inkübe edin. Hücreler inkübe edilirken, altı mililitre tripsin nötralizasyon çözeltisine 12 mikrolitre ROCK inhibitörü ekleyin. Plakaları inkübatörden çıkarın ve altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre nötralizasyon çözeltisi ekleyin.

Her bir kuyucuğun tüm hücrelerini tek bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Altı kuyucuğu da üç mililitrelik bir hacimde PBS ile yıkayın ve bu yıkamayı tüpteki hücrelerle birleştirin. Hücreleri peletlemek için tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin.

Hücreleri FACS'a göre canlı hücre sıralamasına hazırlamak için, buz üzerinde 45 mililitre PBS'ye beş mililitre FBS ve 50 mikrolitre ROCK inhibitörü ekleyerek boyama tamponunu hazırlayın. Süpernatanı peletlenmiş hücrelerden çıkarın ve 1.2 mililitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Askıya alınmış hücrelerin 200 mikrolitresini buz üzerinde önceden soğutulmuş 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunun kalan bir mililitresini buz üzerinde önceden soğutulmuş 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve iki mikrolitre SIRP alfa-PE / Cy7 ve dört mikrolitre CD90-FITC antikoru ekleyin. Hücre süspansiyonunu bir transfer pipeti ile nazikçe karıştırın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrolü içeren iki adet 50 mililitrelik tüpü ve numuneyi bir saat boyunca dört santigrat derecede buz üzerinde bir külbütör çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Hücreler inkübe edilirken, iki adet 15 mililitrelik santrifüj tüpünün her birine iki mililitre farklılaşma ortamı aktarın. Daha sonra üç mikrolitre ROCK inhibitörü ekleyin ve bu FACS toplama tüplerini kullanmadan önce buz üzerinde saklayın. Daha sonra, lekeli hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de peletleyin.

Ve onları 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Numune peletini DAPI içeren bir ila üç mililitre boyama tamponu ile nazikçe yeniden süspanse edin. Negatif kontrol peletine DAPI içermeyen 500 mikrolitre boyama tamponu ekleyin.

Hücre kümelerini çıkarmak için her iki hücre süspansiyonunu da 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün ve ardından bunları buz üzerindeki polistiren FACS tüplerine aktarın. Numuneleri hemen hücre sıralayıcıya getirin. Negatif boyama kontrol numunesinden başlayarak, geçit parametrelerini belirleyin.

Ardından, örnek hücreleri çalıştırırken DAPI negatif canlı hücre popülasyonunu seçin. Hem FITC pozitif hem de PE / Cy7 pozitif hücre popülasyonlarını 20 PSI'da bağımsız olarak toplayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri kültürledikten ve yeniden birleştirdikten sonra, hücre kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın ve ortamı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Plakaları üç mililitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı aynı 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra plakalara üç mililitre% 0.04 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Beş dakika sonra, bir mikroskop kullanarak hücre ayrılması için plakaları inceleyin.

Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, plakalara üç mililitre tripsin nötralizasyon çözeltisi ekleyin. Hücreleri yavaşça karıştırın ve orijinal 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Plakaları beş mililitre PBS ile yıkayın ve bu yıkamayı da tüpe ekleyin.

Hücreleri, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre yenidoğan sığır serumu veya NBS ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Tasarlanmış altı kalp dokusunu oluşturmaya başlamak için, mililitre başına beş miligramın 60.0 mikrolitresini mililitre bir molar sodyum hidroksit, 1.5 mikrolitre 10X PBS ve 9.6 mikrolitre steril ultra saf su ile mililitre başına 3.125 miligrama seyreltin. Burada, hava kabarcıklarının viskoz çözeltiden salınması yavaş olduğundan ve doku sıkışması sırasında doku oluşumuna müdahale edebileceğinden, kollajen karışımına hava kabarcıklarının girmesini önlemek çok önemlidir.

Kollajen karışımını seyreltmek için 10X MEM'in her birine 12.0 mikrolitre ve pH 9'da 0.2 normal yığın eklemek için 15 mililitrelik tüpün kenarını pipetleyin. Daha sonra bazal membran matrisini kollajen karışımına mililitre başına 0.9 miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bu son doku karışımını buz üzerinde saklayın.

Daha sonra, tüm doku karışımını hücre peletine aktarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi ek hücreler ekleyin. Tüpü 150 mikrolitrelik son hacme kadar hücresiz NBS ortamıyla doldurun ve hafifçe karıştırın. Biyoreaktör taban plakasındaki altı oyuğun her birine 25 mikrolitre hücre süspansiyonunu dikkatlice pipetleyin.

Çökelmiş olabilecek hücreleri yeniden süspanse etmek için her bir kuyucuk arasındaki karıştırma prosedürünü tekrarlayın. Doku başına tutarlı bir hacim ve hücre sayısı sağlamak için bir seferde oyuk başına yalnızca bir doku pipetleyin. Ayrı olarak, iki sıra polidimetilsiloksan veya PDMS'yi itin, altı çift karşıt direk oluşturmak için sensörleri polisülfon çerçevenin her iki tarafına kuvvet sensörleri.

Taban plakasının üstündeki çerçeveyi ters çevirin, böylece hücre süspansiyonunu içeren her bir oyuğa bir çift direk girer. Daha sonra biyoreaktörü 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve bu tabağı kapağı olmadan 10 cm'lik bir tabağın içine yerleştirin. Kapağı 10 santimetrelik tabağa yerleştirin ve tüm biyoreaktör düzeneğini doku kültürü inkübatörüne taşıyın.

İki saatlik inkübasyondan sonra, biyoreaktör tertibatını çıkarın ve taban plakasını kaplamak için 14 mililitre NBS ortamı ekleyin. Biyoreaktörü hücre kültürü inkübatörüne geri koyun ve her gün ortamın yarısını değiştirin. 48 saat sonra, taban plakasını her seferinde birkaç milimetre yavaşça çıkarın.

Ardından biyoreaktörü, doku ortama bakacak şekilde geri koyun. Taban plakasını çıkarırken bir direkten bir doku düşerse, dokuyu nazikçe direğe yeniden takın. İnsan embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması, öncelikle kardiyomiyositler ve fibroblastların karışık bir kültürü ile sonuçlanır ve bunlar kendi kendine kümeler halinde organize olur ve çanak boyunca sağlam bir şekilde dövülen ağlar oluşturur.

Bu kültürlerin FACS sınıflandırması, bu farklılaşma yönteminin en az %65 SIRP alfa pozitif hücre ve %10 CD90 pozitif hücre içeren bir popülasyonla sonuçlandığını ortaya koymuştur. Taban plakasını çıkardıktan sonra, insan tarafından tasarlanmış kalp dokularının veya HECT'lerin biyoreaktör içinde kendi kendine bir araya gelmesine izin verilir. Olgun ve sıkıştırılmış HECT'ler, entegre kuvvet algılama direklerini ortalama beş ila 15 mikronewton kuvvetle gözle görülür şekilde saptırır.

Seğirme kuvveti ölçümleri, izole edilmiş değişkenlerin bu tanımlanmış mühendislik dokularındaki kasılma kuvvetini nasıl değiştirdiğini ortaya koymaktadır. Burada, dokular %10 insan mezenkimal kök hücreleri ile desteklendiğinde, hem bir hertz hem de iki hertz pacing frekanslarında kasılma kuvvetinde önemli bir artış gözlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, farklılaşma yaklaşık 20 gün sürecek, hücre sıralaması yaklaşık beş saat ve doku yapısı yaklaşık üç saat sürecektir.

İnşaattan sonra uygun doku oluşumu için yedi gün daha gerekecektir. Bu prosedürü takiben, spesifik hücre-hücre etkileşimlerinin etkileri ile ilgili ek soruları yanıtlamak veya hücre tedavisinin mekanizmalarını belirlemek için hücre etiketleme ve doku karışımının takviyesi dahil olmak üzere diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bilinen ve kontrol edilen bir hücresel bileşime sahip, insan tarafından tasarlanmış kalp dokularının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.