Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, tanımlanmış bir hücresel kompozisyona sahip insan mühendisliği ürünü kardiyak dokular oluşturmaktır. Bu yöntem, değişkenliğin ve kardiyak farklılaşma verimliliğinin kontrol edilmesi ve belirli hücre tiplerinin kardiyak kontraktil fonksiyonu nasıl etkilediğinin anlaşılması dahil olmak üzere, kardiyak doku mühendisliği alanındaki temel zorlukları giderebilir. Bu tekniğin temel avantajı, nihai sonucun kontrollü ve tanımlanmış bir kompozisyona sahip insan mühendisliği ürünü kardiyak doku olmasıdır.

Bu tekniğin tekrarları, tanımlanmış dokuların terapötik müdahaleleri değerlendirebilen yeni, biyolojik olarak ilgili ve biyomedikal bir tarama platformu sağlayabilmesi nedeniyle kalp hastalığı tedavilerine yönelik genişletilmektedir. Bu yöntem yeni kardiyak terapötiklere dair içgörü sağlayabilse de, insan yapımı kardiyak doku sistemi kardiyak hücre tedavisi mekanizmalarını anlamak için de kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücre türevli kardiyomiyosit kültürleri ile başlayarak, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve bir mililitre %0,04 trypsin-EDTA ekleyin.

Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 10 dakika inkübe edin. Hücreler inkübe olurken, 6 mL tripsin nötralizasyon çözeltisine 12 µL ROCK inhibitörü ekleyin. Plakaları inkübatörden çıkarın ve altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna 1 mL nötralizasyon çözeltisi ekleyin.

Her kuyucuktaki tüm hücreleri tek bir 15-mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Altı kuyucuğun tamamını bir kez 3-mililitrelik PBS ile yıkayın ve bu yıkama solüsyonunu tüpteki hücrelerle birleştirin. Hücreleri çöktürmek için tüpü 4 °C'de, 300 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri FACS ile canlı hücre ayıklamaya hazırlamak için, buz üzerinde 45 mililitre PBS'ye beş mililitre FBS ve 50 mikrolitre ROCK inhibitörü ekleyerek boyama tamponunu hazırlayın. Peletlenmiş hücrelerdeki süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 1,2 mililitre boyama tamponu içinde yeniden süspande edin. Süspande edilen hücrelerden 200 mikrolitreyi, buz üzerinde önceden soğutulmuş yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, hücre süspansiyonunun geri kalan bir mililitresini buz üzerinde önceden soğutulmuş yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve iki mikrolitre SIRP alfa-PE/Cy7 ile dört mikrolitre CD90-FITC antikoru ekleyin. Hücre süspansiyonunu bir transfer pipeti ile nazikçe karıştırın ve tüpü buza yerleştirin. Negatif kontrol ve örneği içeren iki 50 mililitrelik tüpü, buz üzerinde, dört santigrat derecede bir saat boyunca bir rocker shaker üzerinde inkübe edin.

Hücreler inkübe olurken, iki adet 15 ml'lik santrifüj tüpünün her birine üç mililitre diferansiyasyon medyumu iki aktarın. Ardından üç mikrolitre ROCK inhibitörü ekleyin ve bu FACS toplama tüplerini kullanımdan önce buz üzerinde saklayın. Sonrasında, boyanmış hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 300 ×g'de pelletleyin.

Ve bunları iki kez 10 milliliters buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Örnek peletini, DAPI içeren bir ila üç milliliters boyama tamponu ile nazikçe yeniden süspande edin. Negatif kontrol peletine DAPI içermeyen 500 microliters boyama tamponu ekleyin.

Hücre kümelerini gidermek için her iki hücre süspansiyonunu da 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün ve ardından buz üzerinde polistiren FACS tüplerine aktarın. Örnekleri derhal hücre ayırıcıya götürün. Negatif boyama kontrol örneği ile başlayarak kapılama (gating) parametrelerini belirleyin.

Ardından, örnek hücreleri çalıştırırken DAPI negatif canlı hücre popülasyonunu seçin. Hem FITC pozitif hem de PE/Cy7 pozitif hücre popülasyonlarını 20 PSI basınçta bağımsız olarak toplayın. Metin protokolünde belirtildiği şekilde hücreleri kültüre alıp yeniden agrege ettikten sonra, hücre kültür plakalarını inkübatörden çıkarın ve besiyerini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Plakaları üç mililitre PBS ile yıkayın ve yıkama sıvısını aynı 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Ardından plakalara üç mililitre %0,04 trypsin-EDTA ekleyin ve 37 °C ve %5 CO2 koşullarında inkübe edin. Beş dakika sonra, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını mikroskop altında inceleyin.

Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, plaklara üç mililitre tripsin nötralizasyon çözeltisi ekleyin. Nazikçe karıştırın ve hücreleri orijinal 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Plakları beş mililitre PBS ile yıkayın ve bu yıkama sıvısını da tüpe ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 ×g'de santrifüj ederek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve pelletini bir mililitre neonatal sığır serumu veya NBS ortamında yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 ×g'de pelletleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Altı mühendislik ürünü kalp dokusunu oluşturmaya başlamak için, 5 mg/mL'lik kolajen stokunun 60,0 µL'sini; 1,5 µL 1 M sodyum hidroksit, 9,6 µL 10X PBS ve 24,9 µL steril ultra saf su ile 3,125 mg/mL'ye seyreltin. Burada, kolajen karışımına hava kabarcığı girmesini önlemek kritiktir; çünkü hava kabarcıkları vizkoz çözeltiden yavaşça ayrılır ve doku sıkıştırması sırasında doku oluşumunu engelleyebilir.

Kollajen karışımını seyreltmek için 15 mililitrelik tüpün kenarından pipetleyerek 12.0 µL 10X MEM ve pH 9'da 0.2 normal HEPES ekleyin. Ardından, bazal membran matriksini kollajen karışımına 0.9 mg/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin ve nazikçe karıştırın. Bu nihai doku karışımını buz üzerinde saklayın.

Ardından, tüm doku karışımını hücre peletine aktarın ve metin protokolünde belirtildiği şekilde ek hücreler ilave edin. Tüpü hücre içermeyen NBS medyum ile 150 microliters nihai hacme tamamlayın ve nazikçe karıştırın. Hücre süspansiyonundan 25 microliters miktarı, biyoreaktör taban plakasındaki altı kuyucuğun her birine dikkatlice pipetleyin.

Çökmüş olabilecek hücreleri tekrar süspansiyona getirmek için her kuyucuk arasında karıştırma işlemini tekrarlayın. Her doku için tutarlı bir hacim ve hücre sayısı sağlamak amacıyla, her seferinde kuyucuk başına yalnızca bir doku pipetleyin. Ayrı olarak, karşılıklı altı çift direk oluşturmak için iki sıra polidimetilsiloksan veya PDMS kuvvet sensörünü polisülfon çerçevenin her iki yanına itin.

Şasiyi, direklerin her bir çifti hücre süspansiyonu içeren kuyucuklara girecek şekilde taban plakasının üzerine ters çevirin. Ardından biyoreaktörü 60 mm'lik bir kaba yerleştirin ve kapağı olmayan bu kabı 10 cm'lik bir kabın içine koyun. 10 cm'lik kabın kapağını kapatın ve tüm biyoreaktör düzeneğini doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

İki saatlik inkübasyonun ardından, biyoreaktör düzeneğini çıkarın ve taban plakasını kaplamak için 14 mililitre NBS besiyeri ekleyin. Biyoreaktörü hücre kültürü inkübasyonuna geri yerleştirin ve besiyerinin yarısını her gün değiştirin. 48 saat sonra, taban plakasını her seferinde birkaç milimetre olacak şekilde nazikçe kaldırın.

Ardından biyoreaktörü, doku ortama bakacak şekilde geri yerleştirin. Taban plakası çıkarılırken bir doku destekten ayrılırsa, dokuyu nazikçe desteğe yeniden tutturun. İnsan embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması, öncelikle kardiyomiyositler ve fibroblastlardan oluşan, kendi kendine kümeler halinde organize olan ve kap boyunca güçlü bir şekilde atan ağlar oluşturan karma bir kültüre yol açar.

Bu kültürlerin FACS sortinglemesi, bu farklılaşma yönteminin en az %65 SIRP alpha pozitif hücre ve %10 CD90 pozitif hücre içeren bir popülasyonla sonuçlandığını ortaya koymuştur. Taban plakası çıkarıldıktan sonra, insan mühendislik ürünü kalp dokularının (HECTs) biyoreaktör içerisinde kendi kendine birleşmesine izin verilir. Olgunlaşmış ve kompakt hale gelmiş HECT'ler, entegre kuvvet algılama direklerini ortalama 5 ile 15 micronewton kuvvetle görünür şekilde saptırır.

Seğirme kuvveti ölçümleri, tanımlanmış bu mühendislik dokularında izole değişkenlerin kasılma kuvvetini nasıl değiştirdiğini ortaya koymaktadır. Burada, dokular %10 insan mezenkimal kök hücreleri ile desteklendiğinde, hem bir hertz hem de iki hertz pacing frekanslarında kasılma kuvvetinde önemli bir artış gözlenmektedir. İşlemde uzmanlaşıldığında, farklılaşma yaklaşık 20 gün, hücre ayıklama yaklaşık beş saat ve doku inşası yaklaşık üç saat sürecektir.

İnşa işleminin ardından, uygun doku oluşumu için yedi gün daha gerekecektir. Bu prosedürü takiben, belirli hücre-hücre etkileşimlerinin etkilerine ilişkin ek soruları yanıtlamak veya hücre terapisinin mekanizmalarını belirlemek amacıyla, hücre etiketleme ve doku karışımının takviye edilmesi dahil diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bilinen ve kontrollü bir hücresel kompozisyona sahip insan yapımı mühendislik ürünü kardiyak dokuların nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.