Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Aşağıdaki deneyin amacı, mikro kontakt baskı yoluyla hizalanmış fonksiyonel miyokard dokusu oluşturmaktır. Bu, poli dimetil siloksan substratları üzerine ilk mikro kontakt fibronektin basılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, çift transgenik.

Embriyonik kök hücre hatları in vitro olarak farklılaştırılır ve floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması yoluyla izole edilir, bu da güçlü kardiyojenik progenitörlerin yüksek oranda saflaştırılmış popülasyonlarının elde edilmesini sağlar. Daha sonra, izole edilmiş kardiyak progenitörler, malign hale getirmek ve kardiyak miyosit benzeri bir çubuk şekli almak için mikro patentli PDMS substratları üzerine ekilir. Gerçeklere ve immünofloresan analizine dayalı olarak kardiyak progenitörlerin başarılı izolasyonunu ve izotropik büyümesini gösteren sonuçlar elde edilir.

İzotropik bir miyokard dokusu oluşturmak, ilaç geliştirme ve keşfi için hastalığa özgü hücre yeniden denemesi geliştirme olasılığını artırarak kök hücre biyolojisi ve doku biyomühendisliği alanlarında ilerlemeye yardımcı olabilir. Ve kardiyak rejeneratif tıbbın temelini atarak. İlk IL koruyucu, 180 4 poli dimetil alan elastomeri 10'a bir bazlı sertleştirici ajan oranında ve iyice karıştırın.

Herhangi bir hava kabarcığını ortadan kaldırmak için bir kurutucu kullanarak düzeneğin gazını alın. PDMS'yi, 20 mikron genişliğinde ve 20 mikron Aralıkla ayrılmış iki mikron takım çıkıntısına sahip önceden üretilmiş bir master'a dökün, ardından mikro dokulu PDMS damgaları elde etmek için oda sıcaklığında bir kuruda iki gün kürleyin. PDMS damgasını oluşturduktan sonra, yüzeyler bir plazma temizleyici ile hidrofilik

Pulları bir dakika boyunca% 70 etanol ile sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabininde, basınçlı hava ile hızlı bir şekilde kurutun. Steril damga yüzeylerini, emilimden sonra en az 10 dakika emmek için fibronektin solüsyonu ile örtün.

Fibronektin solüsyonunu pullardan silkeleyin ve basınçlı hava ile hızlı bir şekilde kurulayın. Damga ile önceden hazırlanmış PDMS kaplamalı cam lameller arasında metin protokolünde anlatıldığı gibi iki dakika boyunca uyumlu temas kurun ve sıkıca bastırın. Mikro desenli alt tabakaları damıtılmış su ile durulayın.

Hemen kullanılmayacakları sürece, en fazla iki hafta dört santigrat derece damıtılmış suda saklayın. Altı kuyulu plakayı damıtılmış suda steril% 0.1 jelatin ile kaplayın ve 15 dakika 37 santigrat derece emmesine izin verin Bu süre zarfında, fare embriyonik fibroblastlarını ahor alikot'tan konik bir tüpte 50 mililitre PBS'ye ekleyerek hazırlayın. Metamfetamini 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin ve metamfetamin ortamında tekrar askıya alın.

Kuluçka süresi geçtikten sonra, fazla jelatini aspire edin ve mes'i kuyucuklara ekleyin. MES'in takılması için bir gün izin verin. Embriyonik kök hücreleri veya ES hücrelerini, konik bir tüp Santrifüjünde 50 mililitre PBS'ye ekleyerek bir düşünce alikotundan hazırlayın.

ES hücreleri beş dakika boyunca 1000 RPM ve Resus bunları ESC ortamında askıya alır. E ES hücrelerini mitleri içeren kuyucuklara ekleyin ve masaj kofluent ES hücrelerine birleşene kadar ESC ortamında tutun. Önce ESC besiyerini aspire edin ve hücreleri steril PBS ile bir kez yıkayın.

Ardından PBS'yi aspire edin ve kuyuya 500 mikrolitre açma ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede üç buçuk dakika inkübe edin. TRIPSIN solüsyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

İlk önce E es hücre kolonilerini parçalayan. Daha sonra kuyuya 500 mikrolitre ESC ortamı ekleyerek tripsin çözeltisini nötralize edin. ES hücrelerine gerekli orana göre masaj yapın, burada E ES hücreleri bir ila 30 oranında geçirilir, bu da üç gün içinde birleşmelerini sağlar.

ES hücreleri birleştiğinde in vitro farklılaşmaya başlayın. İlk önce 10 santimetrelik kültür kaplarını damıtılmış suda steril% 0.1 jelatin ile kaplayın ve 37 santigrat derecede 15 dakika emmesine izin verin. Bu süre zarfında, ES hücrelerini daha önce olduğu gibi hasat edin.

15 dakika geçtikten sonra, fazla jelatini aspire edin ve E ES hücre süspansiyonunun yaklaşık üçte biri ila yarısını adaptasyon ortamı içeren kültürlenmiş kaplara ekleyin. Hücreleri iki gün boyunca adaptasyon ortamında kültürledikten sonra, uyarlanmış ES hücrelerini 1.5 mililitre tripsin kullanarak PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe hasat edin. Bunları 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin ve farklılaştırma ortamında yeniden askıya alın.

15 santimetrelik kültür kaplarında 10 mikrolitrelik farklılaşma ortamı damlası başına yaklaşık 1000 hücreli embriyo gövdeleri veya EBS yapın. Çok kanallı bir pipet kullanarak plakaları ve kültürü ters çevirin. EBS, damlacıkları iki buçuk gün boyunca 37 santigrat derecede asılı tutuyor.

İki buçuk gün sonra, EBS'yi altı ila sekiz adet 15 santimetrelik tabaktan farklılaştırma ortamı kullanarak bir taneye çekin ve üç buçuk gün daha kültürleyin. Üç buçuk gün sonra, EBS'yi 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve tüm ebs'leri toplamak için plakayı bir kez steril PBS ile yıkayın. Sonra yaklaşık beş dakika dibe batmalarına izin verin.

Ardından supinatı çıkarın ve EBS'yi steril PBS ile yıkayın. EBS'nin yaklaşık beş dakika boyunca tekrar dibe batmasına izin verin. 2,5 mililitre tripsin ekleyerek EBS'yi ayırın ve tüpü iki dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda yumuşak bir şekilde çalkalayın.

Daha sonra tripsin çözeltisine 2,5 mililitre steril PBS ekleyin ve hücre kümelerini parçalamak için 10 mililitre serolojik Pipet ile yaklaşık sekiz ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tripsin'i% 7.5 E ES hücresi veya farklılaşma derecesi FBS ve% 0.01 DPI içeren 10 mililitre faks tamponu ile PBS santrifüjünde, beş dakika boyunca 1000 RPM'de ayrışmış EBS ile nötralize edin. Daha sonra supinatı çıkarın ve hücre kümelerini parçalamak için yaklaşık sekiz ila 10 kez bir mililitrelik pipetle yukarı ve aşağı yaklaşık bir mililitre faks tamponu pipeti ekleyin.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri 35 mikronluk bir hücre süzgeci ile steril yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bir aria akış sitometresi kullanarak farklılaşmış ES hücrelerini sıralayın ve taahhüt edilmiş ventriküler progenitörlerin saflaştırılmış popülasyonlarını elde edin. Ayrıntılı geçit stratejisi için protokolün metin kısmına bakın.

Mikro desenli alt tabakaları %1 F1 27 ile damıtılmış suda 10 dakika yedirin. Sonra steril PBS ile üç kez yıkayın. PDMS contalarını desen bölgesinin etrafına takın ve sıkıca bastırın.

Daha sonra kardiyak progenitörleri fibronektin mikro model substratları üzerine tohumlayın. Aşağıdaki görüntüler, altıncı günün in vitro farklılaşmış ES hücrelerinin temsili bir akış sitometrisi tablosundan alınmıştır. Bu görüntü, ileri saçılma genliği FSCA ve yan saçılma genliği SSCA üzerindeki geçitlemeyi gösterir.

Bu, tüm hücrelerin hücresel kalıntılardan ayrılmasına izin verir. Burada FSCA üzerinde geçit ve ileri saçılma genişliği FSCW görülmektedir. Bu, hücre tekillerinin çiftlerden ve diğer hücresel agregalardan izole edilmesine izin verir.

Bu görüntüde SSCA'da geçit oluşturma ve SSCW ile dağıtma gösterilmektedir. Bu, hücre singletlerinin saflığını arttırır. Bu görüntü, canlı DPI negatif hücrelerin canlı olmayan hücrelerden izolasyonuna izin veren FSCA ve DPI boyamasındaki geçitlemeyi göstermektedir.

Burada DI yedide fico, rine, PE ve PE camgöbeği için geçit görülür PE SI yedi. Bu, gerçek kırmızı pozitif ve gerçek kırmızı negatif hücrelerin elde edilmesine ve otofloresan kırmızı negatif hücrelerin dışlanmasına izin verir. Bu görüntüler, kırmızı pozitif ve kırmızı negatif popülasyonlar içindeki gerçek yeşil pozitif ve gerçek yeşil negatif hücrelerin sıralanmasına izin veren floresein izotiyosiyanat genliği uyumlu CA ve PEA için geçitlemeyi göstermektedir.

İn vitro farklılaşmış ES hücrelerinin faks saflaştırması, bu akış sitometrisi grafiğinden görüldüğü gibi dört farklı progenitör popülasyonunu ortaya çıkarır. Dört farklı progenitör popülasyonu kırmızı, pozitif yeşil, pozitif kırmızı, pozitif yeşil, negatif kırmızı, negatif yeşil pozitif ve kırmızı negatif yeşil negatiftir. Bu temsili immünofloresan mikroskopi görüntüsü, mikro desenli fibronektin substratlarını göstermektedir.

Ölçek çubuğu 80 mikronu temsil eder. Bu görüntü, embriyonik türetilmiş gerçeklerin temsili immünofloresan mikroskobunu, üst panellerde izole edilmiş progenitörleri ve ESL'den türetilmiş gerçekleri, fibronektin mikro desenleri üzerinde ek beş günlük bir kültürden sonra alt panellerde izole edilmiş progenitörleri göstermektedir. S-M-M-H-C-A lekeli kırmızı sarkomerik alfa aktinin yeşil görünür.

Ölçek çubuğu 40 mikrondur. Bu videoyu izledikten sonra, yenilenebilir bir kardiyak protus hücre kaynağından anizotropik fonksiyonel miyokard dokusunun nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.