İki katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak doku homeostazının elektromekanik kontrolünün ortaya çıkarılması

Akımların veya alanların hücre yapışmasını, çoğalmasını ve ekstrüzyonunu nasıl düzenleyerek doku homeostazını nasıl etkilediğine odaklanarak, dokuların elektriksel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için kontrollü elektrik alanları uyguluyoruz. Fizyolojik olarak ilgili akımların yönünün doku durumlarını belirlediğini keşfettik. Apikalden bazal alana proliferatif bir fenotip indüklenirken, bazaldan apikale alan hücre ekstrüzyonunu teşvik ederek genel hücre yoğunluğunun modülasyonuna izin verir.

Kantitatif biyoelektrik çalışmalar uzun süredir gravitaksi yoluyla göçe odaklanmış olsa da, doku homeostazı erişilemez durumda. Sistemimiz artık fizyolojik kartonların doku organizasyonunu ve bakımını nasıl düzenlediğinin doğrudan araştırılmasını sağlıyor. Protokolümüz, doku homeostazının elektromekanik kontrolünü incelemek için mikroakışkanları, dokuların elektriksel stimülasyonunu, yapı ve kuvvet mikroskobunu ve canlı görüntülemeyi entegre eder.

Çalışmamız temel elektromekanik bağlantı kurallarını ortaya çıkardı. Yeni araçlarla, artık doğal biyoelektrik modellerin nasıl ortaya çıktığını ve dokuları nasıl düzenlediğini ve bu elektromekanik ipuçlarını ayarlayarak karmaşık doku davranışını kontrol edip edemeyeceğimizi keşfedebiliriz. Başlamak için, temiz bir plastik bulaşık kapağına yüzü yukarı bakacak şekilde bir polidimetilsiloksan veya PDMS kalıbı yerleştirin ve kalıbın üzerine yavaşça 500 mikrolitre sıvı ultraviyole kürlenebilir yapıştırıcı ekleyin.

Bir spatula kullanarak tüm çıkıntılı yapıları dikkatlice ıslatın ve ıslatma işlemi sırasında oluşan hava kabarcıklarını giderin. PDMS kalıbının üzerine bir lamel hafifçe bastırın ve fazla ultraviyole kürlenebilir yapıştırıcıyı çıkarmak için bir laboratuvar sileceği kullanın, lamel üst tarafının temiz ve düz kalmasını sağlayın. Yapıyı, 363 ila 370 nanometre arasında bir dalga boyuna sahip, eşit şekilde aydınlatılmış ultraviyole ışık altında kısmen iyileştirin.

%75etanol kullanarak tüm izleri silin. Ardından, yapıyı düz bir yüzey üzerinde sıkıca tutun ve PDMS kalıbını kürlenmiş birinci katmandan yavaşça soyun. Ardından, 2.5 milimetreden daha kalın düz bir PDMS levhası üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde temiz bir iki PDMS kalıbı yerleştirin.

Cımbız kullanarak kalıp özelliklerine yukarıdan hafifçe vurun. Doğru teması onaylayan karartma veya optik kontrast özelliklerinin altındaki arayüzü gözlemleyin. Şimdi, PDMS kalıbı ile levha arasındaki boşluğu kılcal hareketle sıvı ultraviyole kürlenebilir yapıştırıcı ile doldurun.

Daha önce gösterildiği gibi, yapıyı ultraviyole ışık altında 10 saniye boyunca kısmen sertleştirin. Kompozit ultraviyole kürlenebilir yapışkan tabakayı ve PDMS kalıbını PDMS levhasından nazikçe soymak için yumuşak yastıklı cımbız kullanın. Gerekirse, kürlenmiş yapışkan tabakanın fazla kenarlarını keskin bir makasla kesin.

Ardından, dikdörtgen bir cam lamel üzerine tutturulmuş birinci katmanı düz bir yüzeye yerleştirin. Hala PDMS kalıbına bağlı olan ikinci katmanı birinci katmanla hizalayın ve özelliklerin altında gölgeler görünene kadar her iki katmanı sıkıca bastırın. Birinci ve ikinci katmanları iki katmanlı bir mikroakışkan çipe bağlamak için hizalanmış yapıyı ultraviyole ışık altında 10 saniye kürleyin, ardından PDMS kalıbını bağlı çipten yavaşça soyun.

Hemen 10 mikrolitre poliakrilamid jel öncü solüsyonunu doku bölgesinin ortasına, ikinci katmandaki yarığın hemen üzerine pipetleyin. Düz bir jel oluşturmak için damlacık üzerine 10 milimetre çapında yuvarlak bir cam lamel hafifçe bastırın. Jel çözeltisinin yarıktan birinci katmana aktığını gözlemleyin ve bariyer sütunları sırasında durun.

Birleştirilmiş mikroakışkan çipi hemen ultraviyole ışık altında beş dakika kürleyin. Daha sonra poliakrilamid jelin tamamen katılaşmasını sağlamak için çipi yaklaşık bir saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra, jeli nemlendirmek ve jel ile lamel arasındaki yapışmayı azaltmak için mikroakışkan çipi pH 7.4'te 0.1 molar HEPES tamponunda en az bir saat inkübe edin.

Ardından, lamel jel yüzeyinden çıkarmak için keskin cımbız kullanın. Tıbbi sınıf bir polikarbonat kartuşu, alt yüzü yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye yerleştirin ve kurumuş bir çipi yüzü aşağı bakacak şekilde kartuşla hizalayın. Çip ve kartuş arasındaki yarıklara UV ile kürlenebilen yapıştırıcıyı pipetleyin, bunları kılcal etki ile doldurun ve UV ışığı altında kürleyin.

Üretilen mikroakışkan cihazları, bir biyogüvenlik kabini içinde 200 ila 280 nanometrede ultraviyole ışık altında yerleştirerek sterilize edin. Buz üzerinde 1X DPBS'de mililitre kollajen bir çalışma solüsyonu başına gerekli 50 mikrogram hacmini hazırlayın. Buz üzerinde, daha önce susuz dimetil sülfoksit içinde çözünmüş iki mikrolitre Sulfo-SANPAH stok solüsyonunu, dört santigrat derecede depolanan pH 7.4'te 80 mikrolitre soğuk 0.1 molar HEPES tamponu içinde seyrelterek Sulfo-SANPAH çalışma solüsyonunu hazırlayın.

Poliakrilamid jelin kenarlarını laboratuvar mendilleriyle kurutarak cihazın içinde kurutun. Jel yüzeyine 80 mikrolitre Sulfo-SANPAH çalışma solüsyonu pipetleyerek tam daldırma sağlayın ve Sulfo-SANPAH'ı etkinleştirmek için çipi beş dakika boyunca ultraviyole ışık altında tutun. Jeli pH 7.4'te soğuk 0.1 molar HEPES tamponu ile üç kez durulayın.

Jel üzerine 80 mikrolitre SS çalışma solüsyonu pipetleyerek ve ultraviyole ışık altında beş dakika boyunca ışınlayarak Sulfo-SANPAH tedavisini tekrarlayın. Bu sefer jeli soğuk 1X DPBS ile üç kez durulayın. Son olarak, poliakrilamid jelin üzerine 100 mikrolitre kolajen tek solüsyonunu pipetleyerek tam kaplama sağlayın ve bir saat bekletin.

Bağlanmamış kolajeni 1X DPBS ile üç kez durulayın, ardından jeli daha fazla kullanana kadar 1X DPBS'ye daldırın. Vidaları kullanarak cihazları ek parçalara takın. Ardından, dört adede kadar cihaz ekleme tertibatını mikroskop tablasına monte edilmek üzere tasarlanmış tutucuya sabitleyin.

1X DPBS'yi temizlemek ve değiştirmek için cihazların her bir ana kuyusuna ve atık giderme kanallarından iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra platin elektrotları 45 mililitre ortam içeren tüpe yerleştirin ve ortama tamamen batırıldıklarından emin olun. Kültür ortamını bir şırınga ile Tygon tüpünden çekin ve sıkıca klipsleyin.

Ortamla doldurulmuş borunun bir ucunu elektrot odasına, diğer ucunu da cihaza bağlayın. Şimdi, tripsinizasyon veya hücre süspansiyonu hazırlama önerilerini izleyerek bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve ana kuyuya 0,1 milyon hücre tohumlayın. Kurulumu, elektrot odaları yanlarda olacak şekilde mikroskoba monte edin ve kaynak ölçeri elektrot odasına bağlayın.

Aynı kanal direncine sahip üç cihaz kullanın. Birini kontrol grubu olarak atayın. İkinci cihaza apikalden bazal akıma ve üçüncü cihaza bazalden apikal akıma uygulayın.

Akım kelepçesi modunda bir elektrik sinyali verin ve toplam 20 mikroamperlik bir akım sağlayın. Epifloresan mikroskop ile tüm doku görüntüleme için 20X objektif lensi seçin. Son olarak, kırmızı floresan ve parlak alan kanalları için kanal 561'i seçin.

Uzun süreli görüntüleme sırasında bir saatlik bir zaman aralığı seçin. Farklı akım yönleri altında doku davranışındaki rolünü incelemek için transepitelyal potansiyeli bozmak için hücrelere dik olarak elektrik stimülasyonu uygulandı. Faz kontrast görüntüleme altında, apikalden bazale veya ATB akımları, uygulamadan sonraki 10 dakika içinde hücre bağlantılarının parlamasına neden olurken, kontrol ve bazaldan apikal, BTA koşulları düşük kontrast ve düz apikal yüzeyler gösterdi.

ATB akımları, apikal hücre yüzeyinde dışa doğru bir dışbükeylik üretti. Jel deformasyonu büyük ölçüde akımın yönüne bağlıydı. ATB akımları jeli yukarı doğru çekerken, BTA akımları jeli aşağı doğru sıkıştırdı.

Kavşak E-kaderin yoğunluğu BTA akımları altında arttı, ancak ATB akımları altında kontrole kıyasla önemli ölçüde azaldı. Kavşak aktin yoğunluğu ATB akımları altında azaldı, ancak BTA akımları altında kontrole göre önemli ölçüde artmadı. ATB akımları, tek tabaka boyunca çok hücreli canlı hücre ekstrüzyonlarını tetiklerken, BTA akımları, kontrole benzer şekilde tek tabakalı yapıyı korudu.

Hücre dağılımındaki uzamsal heterojenlik, ATB akımları altında önemli ölçüde daha yüksekti, ancak BTA ve kontrol koşulları altında düşük ve tekdüze kaldı. ATB stimülasyonu altında hücre proliferasyon oranları arttı ve zamanla daha yüksek bölünme oranları oldu. Buna karşılık, BTA akımları daha fazla hücre ölümü olayına neden oldu.