Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

Bu tekniğin genel amacı, nematodların ve nöronlarının, basınç aktüatörleri ile mikroakışkan bir çip kurulumu kullanarak dış mekanik uyaranlara nasıl tepki verdiğini ölçmektir. Bu yöntem, hücrelerin, dokuların ve hayvanların mekanik stimülasyona nasıl tepki verdiği gibi mekanobiyoloji ve duyusal biyoloji alanlarındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mekanik stimülasyon için solucanın kütikülüne erişmeye devam ederken, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin vermek için solucanın hareketliliğini invaziv olmayan bir şekilde yeterince azaltmasıdır.

Bu yöntem, mekanik ipuçlarının gelişim üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir. Hatta ex vivo organ exponse gibi diğer sistemlere veya C.Elegans'a benzer büyüklükteki diğer hayvanlara bile uygulanabilir. GCaMP ve RFP'nin aynı anda uyarılması için bir mikroskop sistemi kurun.

Bir seçenek, yalnızca camgöbeği ve sarı ışığı ileten gizli bir ışık kaynağıdır. Görüntülemek için 10 kat objektif ve yüksek büyütmeli objektif kullanın. Ayrıca, görüntüyü dijital kamera ile bir bilgisayara gönderin.

Ardından, bir çiçeklenme küpü ve gerekirse bir uyarma filtresi ekleyin. Küpe camgöbeği ve sarı ışığı yansıtan ve yeşil ve kırmızı ışığı ileten dikroik bir ayna ekleyin. 570 nanometrede bir kesme ile uzun geçişli dikroik aynalı bir ışın ayırıcı ayarlayın.

Ayrıca, 50 nanometre genişliğinde 525 nanometrede yeşil ışık için bir bant geçiren emisyon filtresi ve 60 nanometre genişliğinde 632 nanometrede kırmızı ışık için bir bant geçiren emisyon filtresi sağlayın. Her iki ışını da kameranın görüş alanına yansıtın. Yeşil kısmın ekranın üst yarısına ve kırmızı kısmın altına yansıtıldığından emin olun.

Daima bir aydan daha eski olan mikroakışkan çipler kullanın. Kurulum için önce yerçekimi akış rezervuarını filtrelenmiş M9 ile yükleyin. Rezervuarı çipin yaklaşık 60 santimetre üzerine yerleştirin ve bir çip çıkışına bağlayın. Ardından, diğer çıkışı iki girişli bir atık kabına bağlayın ve ikinci girişi atık kabına peristaltik bir pompaya bağlayın.

Polietilen boru ile tüm bağlantıları yapın. Ardından, her iki ucunda metal boru konektörleri bulunan 50 milimetre boru uzunlukları olan ara bağlantıları birleştirin. Altı çalıştırma parmağının her birine ve solucan girişine bastırın ve birbirine bağlayın.

Şimdi, çipi optiğin altına yerleştirin. PDMS tekrarlanan manipülasyonlarla hızlı bir şekilde aşınacağından, ara bağlantıları çipe bağlı bıraktığınızdan emin olun. Diyaframın iyi bir kromatik aktivasyonunu sağlamak için PDMS aktüatörünün ve çipi hava rezervuarına bağlayan borunun uygun şekilde kapatılması çok önemlidir.

Hayvanları yüklemeden önce, mikroakışkan çipte basınç kaybı olup olmadığını kontrol edin. İstenilen basınçta birkaç çalıştırma döngüsü gerçekleştirerek diyaframın sapmasını ölçün. Ardından, nicel değerleri teorik tahminlerle karşılaştırın.

Ölçülen değerler beklendiği gibi değilse, boru veya boru konektörlerinde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. PDMS ayrıca, alternatif bir baz polimer ve kürleme maddesi oranı nedeniyle farklı bir elastikiyete sahip olabilir veya PD kütlesi eski ve aşırı çapraz bağlı olabilir. Porta-de-la-Riva ve şirketi tarafından 2012'den itibaren Jove yayınlarında tanımlandığı gibi yaştan genç-yetişkine veya yetişkin-birinci gün C.elegans hazırlamış olmak.

Şimdi, iki ila beş genç yetişkin veya bir günlük hermafrodit seçin. Doğru büyüklükteki hayvanları seçmek çok önemlidir. Küçük hayvanlar kanalda sıkışıp kalmaz ve aşırı büyük hayvanların çıkarılması zor olur ve cihazı tıkayabilir.

Toplanan solucanları bir damla filtrelenmiş M9 içine çekin. Ardından, bunları şırınga gövdesinin içine çekmeden bir mililitrelik bir şırınga kullanarak uzun bir boruya çekin. Ardından, boruyu çipin solucan girişindeki ara bağlantıya bağlayın. Ardından, rezervuara giden vanayı açarak ve pompayı çalıştırarak yerçekimi akışını etkinleştirin.

Şimdi, yakalama kanalını dört kat büyütmede gözlemleyin ve hayvanları nazikçe cihazın içine itin. Hayvanları bekleme odasına yükledikten sonra, pistonu kullanarak bunlardan birini, kafası kanalın konik şekline girecek şekilde yakalama kanalının önüne yavaşça akıtın. Solucan, kanalın tüm kesitini burundan vücudun sonuna kadar doldurmazsa, solucanı çıkarın.

Çoğu zaman, çok küçük olan solucanlar, tuzağa düşmeden doğrudan çipten geçer. Yakalama kanalına takılan bir hayvanın çıkarılması gerekiyorsa, solucan kanaldan kaybolana kadar şırınganın pistonuna bastırın ve ardından yeni bir solucan yükleyin. Bir solucan düzgün bir şekilde yüklendikten sonra, çiçeklenme moduna geçin ve büyütmeyi artırın.

Doygunluğu önlemek için, uyarma yoğunluğunu çiçeklenme yoğunluğuna göre ayarladığınızdan emin olun. İlgilenilen bir nöronun nöritinin aktüatörlerden birinin diyaframı boyunca uzanıp uzanmadığını kontrol edin. Bu aktüatör aynı zamanda nöronun hücre gövdesinin önünde olmalıdır.

Değilse, pistonu çekerek veya iterek hayvanın konumunu ayarlayın. Bu işe yaramazsa, solucanı çıkarın ve yeni bir tane yükleyin. Ayrıca, nöron etrafında otofloresan varsa, solucanı değiştirin.

Bir solucan düzgün bir şekilde yüklendikten sonra, ilgilenilen nöronun hücre gövdesine odaklanın, ardından çipin ön tarafında hangi aktüatörün olduğunu belirleyin ve bu aktüatörü ilgili ara bağlantıyı kullanarak programlanabilir basınç pompasına bağlayın. Deney, aktüatör ile nöron arasındaki mesafenin ölçülmesini gerektiriyorsa, her ikisini de kanal duvarı görüntünün üst ve alt kenarına paralel olacak şekilde görüş alanına yerleştirin. Ardından, programlanabilir basınç pompasını kullanarak bir basınç protokolü tanımlayın.

Bir taban çizgisi tanımlamak için her zaman sıfır kilopaskalda en az 50 görüntü çekerek başlayın. Ardından, uyaran dalga biçimini ve basıncını programlayın. Şimdi, görüntüleme ve basınç protokolünü çalıştırın.

Kayıt yaparken, ilgilenilen nöron 10 piksellik bir alandaki en parlak nokta olmalıdır. Ardışık iki görüntüde 10 pikselden fazla hareket edemez ve görüş alanında kalmalıdır. Kayıt sırasında, basınç ve aktüatörler değiştiğinde çiçeklenme yoğunluğundaki değişiklikleri gözlemleyebilirsiniz.

Bu, nöronların başarılı bir şekilde uyarıldığını gösterir. Uyaranlar arasında, sıfır kilopaskal sabit bir basınçta 10 saniye ekleyin. Tüm kayıt boyunca en az 10 piksel ile ayrıldıkları sürece, görüş alanındaki birden fazla nörondan gelen sinyalleri aynı anda kaydetmek mümkündür.

Solucanları daha fazla çalışma için tutmak için, çipin çıkışlarını yerçekimi akışına ve atık kabına doğru ayırın. Ardından, tüm solucan yakalama kanalından akış kanalına itilene kadar pistona hafifçe bastırın ve hayvan çipin dışında bir damlacık içinde görünene kadar pistona basmaya devam edin. Şimdi, şırıngayı boru ile ayırın ve damlacıktaki solucanı bir agar plakasına aspire edin.

Kanaldaki bir solucanı çıkarmak ve feda etmek için, tüm solucan yakalama kanalından akış kanalına itilene kadar pistona bastırın. Daha sonra, solucan çipten dışarı ve atık kabına akacaktır. Mikroakışkan çipi kurduktan sonra, diyaframın sapması test edildi.

Ölçülen değerler, 450 kilopaskal basınçta bir mikronu aşmayan hafif bir değişiklikle tekrarlanabilirdi. Solucanlar çipin girişine yerleştirildikten sonra, yakalama kanalının içindeki tek bir hayvanın derisi altı aktüatöre sunuldu. Bu tasarımla, PLM nöronu genellikle tamamen hareketsiz hale getirilemez, bu nedenle yanal ve dikey olarak hareket etmekte serbesttir.

PLM nöronlarının başarılı bir şekilde aktivasyonu mümkün olsa da, kuyruk hareketi nedeniyle onlardan kalsiyum geçişlerini kaydetmek zordur. Yerleştirildikten sonra, hayvan, altı TRN'nin her birine mekanik uyaranlar iletmek üzere konumlandırılmış altı aktüatörden biri kullanılarak uyarıldı. Üç farklı iki saniyelik uyarandan biri sunuldu.

275 kilopaskal'da bir tutma, 275 kilopaskal'a bir rampa veya 275 kilopaskal adımla üst üste bindirilmiş 75 kilopaskal 10 hertz sinüsten oluşan bir vızıltı. Basınç olmadan 10 saniyelik boşluklar uyaranları ayırdı. Basınç rampaları ve basınç adımları, yalnızca uyaranlar 400 kilopaskalın üzerindeki basınçlara ulaştığında TRN'leri aktive ederken, vızıltı uyaranları tüm TRN'yi sağlam bir şekilde aktive etti.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik solucan başına beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. Çip ile lamel arasındaki veya çip ile ara bağlantılar arasındaki zayıf bir sızdırmazlığın, cihazın sızmasına ve arızalanmasına neden olacağını unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nosiseptörlerin mekanik tepkisini karakterize etmek için voltaj görüntüleme veya mekanik uyaranların farklı nöronlara hedefli olarak verilmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Ayrıca, hayvanlar bu prosedürü takiben kurtarılabildiğinden, teknik, mekanik uyaranlara tepkilerinde kusurlu olan mutantları taramak için kullanılabilir. Sıkıştırılmış gazlar ve kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu tehlikelerden kaçınmak için kişisel koruyucu giysiler giymek ve gerektiğinde çeker ocaklarda çalışmak gibi önlemler alın.