Saccharomyces cerevisiae'de yeni başlayan ve olgun transkriptlerin karşılaştırmalı RNA yapısı analizi
27 Şubat 2026
RNA ikincil yapısı öncelikle olgun RNA'da yapı araştırma yöntemleriyle gözlemlenmiştir. Ortak transkripsiyonel Yapı İzleme dizileme (CoSTseq), yeni başlayan RNA'da polimeraz pozisyonunu incelemek için kullanılan nükleer akım sürecini yapı araştırması ile birleştirir. CoSTseq, aktif transkripsiyon altında RNA'da ikincil yapının gözlemlenmesini sağlar.
Kotranskripsiyonel RNA işleme üzerine çalıştık ve bu, RNA'nın sentezlenen RNA polimerazından ortaya çıktığında nasıl katlandığını da kapsıyor. Bu yöntemden önce, RNA'nın sentez sırasında nasıl katlandığını izleyemiyorduk ve bu da araştırmamızda bizi engelliyordu. Bu yeni yöntem bu boşlukları aşıyor.
CoSTseq, mayada yeni başlayan RNA katlanmasını araştırmak için geliştirilmiştir. Özellikle çok bol bulunan RNA'ların analizinde etkilidir. Başlamak için, Saccharomyces cerevisiae süzü BY4741'i 50 mililitre YPAD ortamında aşılayın ve 30 derece Celsius'ta inkübe yapın; kültür orta günlük faza ulaşana kadar dakikada 200 devirde sallayın.
Yaklaşık üç mililitre maya kültürü (1.8 optik yoğunluk birimine karşılık gelir) toplanın ve önceden soğutulan bir santrifüj ile dört derece Celsius'ta üç dakika boyunca 2.500 x g sıcaklıkta santrifüj yapın. Süpernatantı atık konteynerine atın. Pelleti 10 mililitre soğuk PBS'ye tekrar askıya alın ve tekrar 2,500 x g sıcaklıkta üç dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın.
Üst maddeyi çıkarın ve maya pelletini buzun üzerinde tutun. Maya pelletini 10 mililitre soğuk %0,5 sarkosil içinde dikkatlice tekrar askıya alın, kabarcık oluşturmadan. Yeniden süzülen maya buzun üzerinde 20 dakika kuluçka geçirin ki geçirimlilik sağlansın, ardından hücreleri 400 x g hassasiyetinde dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca pellet edin ve geçirgen maya hücrelerini P-1000 pipeti kullanılarak 100 mikrolitre nükleazsız suya geri aldınız.
Yeni eklenen beş milimolar ditiothreitol ile 2.5X transkripsiyon tamponundan oluşan çalışma çözeltisi hazırlayın ve 2.5X yapı problama tamponunu 30 derece Celsius'a kadar önceden ısıtın. Temiz bir iki mililitrelik tüpte gerekli tüm reaksiyon bileşenlerini ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra, hazırlanmış maya hücrelerinden 100 mikrolitre reaksiyon tüpünü ekleyin ve termomikserde 30 derece Celsius sıcaklığında inkübe yapın, dakikada 500 devirde iki dakika boyunca çalkalayın.
Sonra hızlıca 200 mikrolitre önceden ısıtılmış 2.5X yapı probing tamponu ve aynı anda 25 mikrolitre dimetil sülfat reaktifi ekleyin. Tüpü iki darbede nazikçe girdablandırın ve 30 derece Celsius ile dakikada 500 devirde ayarlanmış kuluçka makinesine geri yerleştirin. Termomikserde dört dakika boyunca inkübe yapmaya devam edin, örnekler arasında 30 saniye aralık bırakın.
Stop ve tamponları önceden hazırlayın ve kullanana kadar buzun üzerine koyun. Reaksiyon tüpüne bir mililitre stop buffer ekleyerek dimetil sülfat metilasyonunu durdurun. Şimdi, 3.500 x g ile etiketlenmiş örnekleri ön soğutma santrifüjünde beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Dönmeden sonra üst malzemeyi uygun bir atık konteynerine atın. Pellete bir mililitre soğutucu yıkama tamponu ekleyin ve tekrar askıya alın. Santrifüjasyonu 3.500 x g ile beş dakika boyunca tekrarlayın.
Hemen RNA ekstraksiyonuna geçin ve maya pelletini dondurmayın. Dimetil sülfat etiketli maya pelletini 600 mikrolitre RNA lizis tamponu içinde yeniden süspansiyona yerleştirin ve ardından süspansiyonu %20 sodyum dodesil sülfat içeren 40 mikrolitre bir tüpte aktarın. Örneği 65 derece Celsius'ta 30 saniye boyunca inkübe edin, dakikada 950 devirde sarsın.
Sonrasında, standart prosedüre uygun olarak RNA'nın fenol-kloroform ekstraksiyonu yapılacaktır. Streptavidin manyetik boncuklarını girdabla vurun ve her 80 mikrogramlık toplam RNA örneği için 44 mikrolitre boncukları yeni bir tüpe aktarın. Manyetik boncukları, boncuklar yerleşene kadar manyetik bir rafa yerleştirin.
Depolama tamponu çıkarıldıktan sonra, boncukları bir mililitre ön yıkama tamponu A'da tekrar askıya alın. Şimdi süspansiyonu oda sıcaklığında iki dakika kuluçka edin, ardından manyetize edilip üst tamponu çıkarın. Yıkamadan sonra, boncukları 88 mikrolitre 2X bağlama tamponunda tekrar askıya alın. 80 mikrolitre, 80 mikrolitrelik biyotinillenmiş RNA örneği içeren steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Boncuk örneği karışımını oda sıcaklığında bir rotator üzerinde 20 dakika boyunca döndürün. Sonra tüpü manyetik rafın üzerine yerleştirerek olgun RNA içeren akışı toplayın ve DMS-MaPseq iş akışını kullanarak olgun RNA'ların poli-A seçimini yapmak için çökeltme için saklayın. Sonra, boncuk-gelişen RNA kompleksini 500 mikrolitre yüksek tuzlu tampon ile iki kez durulayın.
Sonra 500 mikrolitre 1X bağlama tamponu ile bir kez durulayın, ardından son olarak 500 mikrolitre düşük tuzlu tampon ile durulayın. Şimdi boncuk=yeni başlayan RNA kompleksine 300 mikrolitre RNA reaktifi ekleyin, iyice süzülün ve termomikserde 60 derece Celsius'ta beş dakika kuluçka yapın. Sonra, 60 mikrolitre kloroform, vorteks ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçka yapın.
Numuneyi 14.000 x g ile ön soğutma santrifüjünde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, üst sulu fazı yaklaşık 180 mikrolitre yeni bir toplama tüpüne aktarın. Kalan organik fazı atın, geride boncuklar ve kalan sulu çözelti bırakın.
Yeni başlayan RNA'yı arıttıktan sonra, şablon anahtarlama ters transkripsiyonunu gerçekleştirin, 5' adaptörü bağlanın ve dizileme için kütüphaneleri seçin. Test PCR ürünlerinin %1 agaroz jel üzerinde görselleştirilmesi, minimum primer dimer oluşumu ve 300 baz çifti civarında karakteristik bir baz yayma ortaya koydu; bu da ko-transkripsiyonel yapı dizileme veya CoSTseq ve DMS-MaPseq kütüphaneleri için kullanıldı. CoSTseq örneği bir için elektroferogram, yaklaşık 285 baz çifti civarında zirve noktası olan kütüphane boyut dağılımını doğruladı.
ASC1 mRNA'nın okuma hizası, CoSTseq kütüphanesinin intron boyunca kapsama içerdiğini ve RNA'nın yeni başladığını doğruladığını ortaya koydu. DMS-MaPseq kütüphanesi ise intron kapsamasına sahip değildi, bu da RNA'nın olgun olduğunu gösteriyordu. 18S pre-rRNA'nın kot transkripsiyonel katlanma matrisi, DMS reaktivitesinin, RNA polimerazın rDNA lokusu boyunca 790 pozisyondan 811 pozisyonuna ilerlemesiyle ani değişiklikler gösterdiğini ortaya koydu.
ADH1 mRNA'nın DMS reaktivite analizi, yeni başlayan ve olgun formlar arasında benzer profiller gösterdi ve bu da yapısal stabilite bölgelerini gösterdi. Buna karşılık, SSA2 mRNA, yeni başlayan ve olgun formlar arasında farklı DMS reaktivite bölgeleri göstermiştir; bu da olgunlaşma sırasında yapısal değişiklikleri önermektedir. CoSTseq ile araştırmacılar, in vivo yeni yaranan RNA ikincil yapılarını ve RNA polimerazın RNA transkriptleri üzerindeki konumunu belirleyebilirler.
CoSTseq zaman hassasiyetli adımlara sahip, toksik kimyasallar kullanıyor. Aynı anda en fazla iki örneği işlemek daha iyidir. CoSTseq'ten üretilen toplam RNA'dan, biyotinillenmemiş RNA'lar, geleneksel DMS-MaPseq kullanılarak eşzamanlı olgun yapı araştırması için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
This article presents Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq), a method for probing the secondary structure of nascent RNA as it emerges from RNA polymerase in Saccharomyces cerevisiae. CoSTseq enables simultaneous mapping of RNA polymerase position and RNA base pairing status, overcoming previous limitations in studying transient, low-abundance nascent transcripts. The protocol also allows parallel analysis of mature RNA structures using DMS-MaPseq.
Key Study Components
Area of Science
- RNA biology
- Structural genomics
- Molecular genetics
Background
- RNA secondary structures formed during transcription influence gene expression, RNA processing, translation, and stability.
- Traditional methods primarily analyze mature RNA, leaving nascent RNA folding poorly understood.
- Nascent RNAs are rare and transient, making their isolation and structural characterization challenging.
- Understanding cotranscriptional folding is critical for elucidating RNA function and regulation.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a protocol for capturing the structure of nascent RNA in vivo.
- To simultaneously determine RNA polymerase position and RNA base pairing status during transcription.
- To compare nascent and mature RNA structures within the same experimental framework.
Methods Used
- Growth and preparation of S. cerevisiae cultures.
- Transcriptional run-on with biotin-NTP incorporation to stall RNA polymerase at active sites.
- DMS (dimethyl sulfate) treatment to methylate unpaired A, C, and U nucleotides in RNA.
- Biotin-based enrichment of nascent RNA using streptavidin magnetic beads.
- RNA extraction, reverse transcription with template switching, and library preparation for sequencing.
- Parallel DMS-MaPseq workflow for mature RNA structure analysis.
Main Results
- CoSTseq libraries showed coverage across introns, confirming capture of nascent RNA, while DMS-MaPseq libraries lacked intron coverage, indicating mature RNA.
- DMS reactivity profiles revealed abrupt structural changes in 18S pre-rRNA as RNA polymerase progressed along the gene.
- ADH1 mRNA displayed similar DMS reactivity in nascent and mature forms, suggesting structural stability.
- SSA2 mRNA exhibited differences in DMS reactivity between nascent and mature forms, indicating structural remodeling during maturation.
Conclusions
- CoSTseq enables in vivo mapping of nascent RNA secondary structures and RNA polymerase positions.
- The method provides insights into cotranscriptional RNA folding and structural transitions during RNA maturation.
- CoSTseq can be performed alongside DMS-MaPseq for comprehensive analysis of RNA structure dynamics.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq) enables direct analysis of nascent RNA folding and polymerase position in vivo, addressing a critical gap in understanding RNA structure dynamics during transcription. This capability enhances predictive confidence in gene regulation studies and supports mechanistic de-risking at the target validation stage. Integrating nascent and mature RNA structure analysis informs early discovery decisions and portfolio triage in RNA-targeted drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA folding states as transcripts emerge from RNA polymerase.
- Supports functional target validation by mapping structural transitions relevant to gene regulation.
- Improves predictive confidence in RNA-targeted therapeutic hypotheses.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing stable versus dynamic RNA regions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA structure datasets for downstream screening workflows.
- Enables assay standardization by providing quantitative DMS reactivity profiles.
- Supports reproducibility through parallel analysis of nascent and mature transcripts.
- Facilitates reliable evaluation of compound effects on RNA structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns RNA structure analysis with disease-relevant gene expression systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of RNA-targeted mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement by revealing structural remodeling during RNA maturation.
- Supports mechanistic de-risking for RNA-based therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
CoSTseq integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling comprehensive RNA structure analysis at multiple pipeline stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nascent RNA folding in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible DMS reactivity outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers paired-end sequencing data to compare structural states across transcript maturation.
- Translational Research: Connects RNA structure dynamics to disease-relevant gene expression and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA structure analysis across diverse targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes RNA structure probing with scalable, parallelizable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying RNA structural transitions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, sequencing, and chemical probing techniques.
- Needs access to paired-end sequencing platforms and analytical infrastructure for DMS reactivity analysis.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or RNA abundance levels.
- Throughput is limited by time-sensitive steps and handling of toxic chemicals.
