Saccharomyces cerevisiae'de yeni başlayan ve olgun transkriptlerin karşılaştırmalı RNA yapısı analizi

Kotranskripsiyonel RNA işleme üzerine çalıştık ve bu, RNA'nın sentezlenen RNA polimerazından ortaya çıktığında nasıl katlandığını da kapsıyor. Bu yöntemden önce, RNA'nın sentez sırasında nasıl katlandığını izleyemiyorduk ve bu da araştırmamızda bizi engelliyordu. Bu yeni yöntem bu boşlukları aşıyor.

CoSTseq, mayada yeni başlayan RNA katlanmasını araştırmak için geliştirilmiştir. Özellikle çok bol bulunan RNA'ların analizinde etkilidir. Başlamak için, Saccharomyces cerevisiae süzü BY4741'i 50 mililitre YPAD ortamında aşılayın ve 30 derece Celsius'ta inkübe yapın; kültür orta günlük faza ulaşana kadar dakikada 200 devirde sallayın.

Yaklaşık üç mililitre maya kültürü (1.8 optik yoğunluk birimine karşılık gelir) toplanın ve önceden soğutulan bir santrifüj ile dört derece Celsius'ta üç dakika boyunca 2.500 x g sıcaklıkta santrifüj yapın. Süpernatantı atık konteynerine atın. Pelleti 10 mililitre soğuk PBS'ye tekrar askıya alın ve tekrar 2,500 x g sıcaklıkta üç dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın.

Üst maddeyi çıkarın ve maya pelletini buzun üzerinde tutun. Maya pelletini 10 mililitre soğuk %0,5 sarkosil içinde dikkatlice tekrar askıya alın, kabarcık oluşturmadan. Yeniden süzülen maya buzun üzerinde 20 dakika kuluçka geçirin ki geçirimlilik sağlansın, ardından hücreleri 400 x g hassasiyetinde dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca pellet edin ve geçirgen maya hücrelerini P-1000 pipeti kullanılarak 100 mikrolitre nükleazsız suya geri aldınız.

Yeni eklenen beş milimolar ditiothreitol ile 2.5X transkripsiyon tamponundan oluşan çalışma çözeltisi hazırlayın ve 2.5X yapı problama tamponunu 30 derece Celsius'a kadar önceden ısıtın. Temiz bir iki mililitrelik tüpte gerekli tüm reaksiyon bileşenlerini ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra, hazırlanmış maya hücrelerinden 100 mikrolitre reaksiyon tüpünü ekleyin ve termomikserde 30 derece Celsius sıcaklığında inkübe yapın, dakikada 500 devirde iki dakika boyunca çalkalayın.

Sonra hızlıca 200 mikrolitre önceden ısıtılmış 2.5X yapı probing tamponu ve aynı anda 25 mikrolitre dimetil sülfat reaktifi ekleyin. Tüpü iki darbede nazikçe girdablandırın ve 30 derece Celsius ile dakikada 500 devirde ayarlanmış kuluçka makinesine geri yerleştirin. Termomikserde dört dakika boyunca inkübe yapmaya devam edin, örnekler arasında 30 saniye aralık bırakın.

Stop ve tamponları önceden hazırlayın ve kullanana kadar buzun üzerine koyun. Reaksiyon tüpüne bir mililitre stop buffer ekleyerek dimetil sülfat metilasyonunu durdurun. Şimdi, 3.500 x g ile etiketlenmiş örnekleri ön soğutma santrifüjünde beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Dönmeden sonra üst malzemeyi uygun bir atık konteynerine atın. Pellete bir mililitre soğutucu yıkama tamponu ekleyin ve tekrar askıya alın. Santrifüjasyonu 3.500 x g ile beş dakika boyunca tekrarlayın.

Hemen RNA ekstraksiyonuna geçin ve maya pelletini dondurmayın. Dimetil sülfat etiketli maya pelletini 600 mikrolitre RNA lizis tamponu içinde yeniden süspansiyona yerleştirin ve ardından süspansiyonu %20 sodyum dodesil sülfat içeren 40 mikrolitre bir tüpte aktarın. Örneği 65 derece Celsius'ta 30 saniye boyunca inkübe edin, dakikada 950 devirde sarsın.

Sonrasında, standart prosedüre uygun olarak RNA'nın fenol-kloroform ekstraksiyonu yapılacaktır. Streptavidin manyetik boncuklarını girdabla vurun ve her 80 mikrogramlık toplam RNA örneği için 44 mikrolitre boncukları yeni bir tüpe aktarın. Manyetik boncukları, boncuklar yerleşene kadar manyetik bir rafa yerleştirin.

Depolama tamponu çıkarıldıktan sonra, boncukları bir mililitre ön yıkama tamponu A'da tekrar askıya alın. Şimdi süspansiyonu oda sıcaklığında iki dakika kuluçka edin, ardından manyetize edilip üst tamponu çıkarın. Yıkamadan sonra, boncukları 88 mikrolitre 2X bağlama tamponunda tekrar askıya alın. 80 mikrolitre, 80 mikrolitrelik biyotinillenmiş RNA örneği içeren steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Boncuk örneği karışımını oda sıcaklığında bir rotator üzerinde 20 dakika boyunca döndürün. Sonra tüpü manyetik rafın üzerine yerleştirerek olgun RNA içeren akışı toplayın ve DMS-MaPseq iş akışını kullanarak olgun RNA'ların poli-A seçimini yapmak için çökeltme için saklayın. Sonra, boncuk-gelişen RNA kompleksini 500 mikrolitre yüksek tuzlu tampon ile iki kez durulayın.

Sonra 500 mikrolitre 1X bağlama tamponu ile bir kez durulayın, ardından son olarak 500 mikrolitre düşük tuzlu tampon ile durulayın. Şimdi boncuk=yeni başlayan RNA kompleksine 300 mikrolitre RNA reaktifi ekleyin, iyice süzülün ve termomikserde 60 derece Celsius'ta beş dakika kuluçka yapın. Sonra, 60 mikrolitre kloroform, vorteks ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçka yapın.

Numuneyi 14.000 x g ile ön soğutma santrifüjünde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, üst sulu fazı yaklaşık 180 mikrolitre yeni bir toplama tüpüne aktarın. Kalan organik fazı atın, geride boncuklar ve kalan sulu çözelti bırakın.

Yeni başlayan RNA'yı arıttıktan sonra, şablon anahtarlama ters transkripsiyonunu gerçekleştirin, 5' adaptörü bağlanın ve dizileme için kütüphaneleri seçin. Test PCR ürünlerinin %1 agaroz jel üzerinde görselleştirilmesi, minimum primer dimer oluşumu ve 300 baz çifti civarında karakteristik bir baz yayma ortaya koydu; bu da ko-transkripsiyonel yapı dizileme veya CoSTseq ve DMS-MaPseq kütüphaneleri için kullanıldı. CoSTseq örneği bir için elektroferogram, yaklaşık 285 baz çifti civarında zirve noktası olan kütüphane boyut dağılımını doğruladı.

ASC1 mRNA'nın okuma hizası, CoSTseq kütüphanesinin intron boyunca kapsama içerdiğini ve RNA'nın yeni başladığını doğruladığını ortaya koydu. DMS-MaPseq kütüphanesi ise intron kapsamasına sahip değildi, bu da RNA'nın olgun olduğunu gösteriyordu. 18S pre-rRNA'nın kot transkripsiyonel katlanma matrisi, DMS reaktivitesinin, RNA polimerazın rDNA lokusu boyunca 790 pozisyondan 811 pozisyonuna ilerlemesiyle ani değişiklikler gösterdiğini ortaya koydu.

ADH1 mRNA'nın DMS reaktivite analizi, yeni başlayan ve olgun formlar arasında benzer profiller gösterdi ve bu da yapısal stabilite bölgelerini gösterdi. Buna karşılık, SSA2 mRNA, yeni başlayan ve olgun formlar arasında farklı DMS reaktivite bölgeleri göstermiştir; bu da olgunlaşma sırasında yapısal değişiklikleri önermektedir. CoSTseq ile araştırmacılar, in vivo yeni yaranan RNA ikincil yapılarını ve RNA polimerazın RNA transkriptleri üzerindeki konumunu belirleyebilirler.

CoSTseq zaman hassasiyetli adımlara sahip, toksik kimyasallar kullanıyor. Aynı anda en fazla iki örneği işlemek daha iyidir. CoSTseq'ten üretilen toplam RNA'dan, biyotinillenmemiş RNA'lar, geleneksel DMS-MaPseq kullanılarak eşzamanlı olgun yapı araştırması için kullanılabilir.