Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz Yerinde Hibridizasyon Saccharomyces cerevisiae

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek maya hücrelerinde tek molekül özgüllüğüne sahip mRNA moleküllerinin varlığını tespit etmektir. İlk olarak, maya hücrelerini ve formaldehiti liyaz içeren tampon kullanarak sabitleyin. Çoğu hücre faz parlak olmayana kadar hücreleri geçirgendir.

Daha sonra, perme hücrelerini floresan etiketli tek sarmallı DNA Molekülleri ile inkübe edin, ardından hücreleri plazma ile temizlenmiş bir örtü kızağı üzerine monte edin. Sonuç olarak, floresan mikroskobu ile elde edilen sonuçlar, tek hücrelerde mRNA moleküllerinin varlığını ve lokalizasyonunu detaylandırabilir. Bu tekniğin gen ekspresyonu, mikrodiziler ve kuzey lekeleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tek tek mRNA'ların tek hücrelerde görüntülenebilmesidir.

Bu yöntem, transkripsiyon alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, bir popülasyondaki hücre başına kol RNA'larının sayısının ölçülmesini içerir ve bu da promotör düzeyinde düzenleme modellerini bilgilendirebilir. Hücre döngüsü sırasında transkriptlerin lokalizasyonunu ve yarı ömürlerini belirlemek için de kullanılabilir.

Bir plazma preen vakum odası pozisyonunda, kapak kızakların üzerine kayar. Ardından vakum odasını bir mikrodalgaya yerleştirin ve sızdırmaz olduğundan emin olun. Pompa çalıştırıldıktan sonra pompayı açın.

Vakumu açın, şimdi mikrodalga fırını açın ve plazma göründükten beş saniye sonra durun. Ardından vakumu ve ardından pompayı kapatın. Vakum odasını dışarı çekin.

Daha sonra kapak fişlerini temizlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde 12'ye aktarın. Kuyu plakaları, mayayı yaklaşık 0.1 ila 0.2 arasında bir A 600'e kadar büyütür. Minimal ortamda, 10 mil hücre yaklaşık 10 hibridizasyon için yeterli verim sağlar.

10'uncu hacimde %37'lik formaldehiti doğrudan büyüme ortamına ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 3000 Gs'de santrifüjleyin. Peleti bir mililitre tampon B içinde yeniden süspanse edin ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre buz gibi soğuk tampon B ile iki kez yıkayın. Bir dakika boyunca 13.000 RPM'de santrifüjleyin. Daha sonra, bir mililitre sfero kaplama ekleyin, tamponlayın ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Çoğu hücre siyah olana kadar hücreleri birkaç dakikada bir mikroskobik olarak izleyin. Ardından buz gibi soğuk tampon ile iki kez yıkayın. B. 3, 500 RPM düşük hızda eğirme.

Bir mililitre% 70 etanol reçinesi ekleyin. Peleti nazikçe askıya alın ve gece boyunca dört santigrat derecede yerleştirin veya eksi 20 santigrat derecede süresiz olarak saklayın. Hibridizasyon çözeltisini hazırlamak için, 100 mikrolitre hibridizasyon tamponuna bir ila üç mikrolitre prob ekleyin.

Sonra girdap ve santrifüj. Üç farklı prob seti kullanarak aynı anda üç farklı geni görüntüledik. Şimdi santrifüjleyin, sabit maya numunesini alın ve yıkama tamponundan aspire edin.

Hibridizasyon çözeltisini ekleyin ve ertesi gün 37 santigrat derecede gece boyunca hafifçe çalkalayarak karanlıkta inkübe edin. Temiz kapak dudaklarına beş dakika boyunca 150 mikrolitre% 0.01 polilisin uygulayın. Sonra aspir edin ve havayla kurutun.

Slaytlar damıtılmış su ile üç kez yıkanır ve bir XSSC Resus ile yıkandıktan sonra havayla kurulanır, hücreleri mililitre başına 150 mikrolitre 0.1 mikrogram içinde askıya alır. Taze hazırlanmış benekli leke, hücre süspansiyonunu polilisin ile muamele edilmiş kapak kaymaları üzerine bir alikot lekeleyin ve 30 dakika inkübe edin. Ardından, uzun süreli altın montaj ortamını oda sıcaklığına çözün.

Bir slayta üç mikrolitre yerleştirin. Daha sonra bir kapak fişine yaklaşık 0,5 mililitre etanol ekleyin. 12 oyuklu plakada, kapak kızağını çıkarın ve cımbızla tutarken havayla kurutun.

Kapak kayma hücresi aşağı bakacak şekilde montaj ortamına yerleştirin ve karanlıkta birkaç saat veya gece boyunca sertleşmesine izin verin. Kenarları oje ile kapatın ve görüntülemeye devam edin. Toplam mesafenin 0.2 mikrometre boyutunda beş mikrometre olduğu referans noktasının etrafında bir Zack görüntüsü alın.

Her prob setine karşılık gelen her boya kanalı için görüntülemeyi tekrarlayın. Ardından ekteki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ilerleyin. Hücreleri havza segmentasyonu ile tanımlamak için, radyal bir gradyan kullanarak noktaları tanımlayın ve Gauss uyumu kullanarak noktaları ölçün.

Tipik olarak, histogramlar balık görüntülerinden hesaplanır ve tek hücrelerde bulunan mRNA'ların sayısını belirlemek için kullanılır. Mikroskopi tabanlı RNA miktar tayininin önemli bir avantajı, transkriptlerin lokalizasyonu hakkında bilgi elde edilebilmesidir. Örneğin, bu balık, indüklenebilir bir CCB CBF bir aleli olan tek hücrelerdeki mRNA'ları tanımlamak için tek problar kullanır.

Transkripsiyon bölgesinde birçok mRNA molekülü bulunduğundan, çekirdek içindeki transkripsiyon bölgelerinin varlığını ve yerini belirlemek kolaydır. Farklı genlerin mRNA'larını etiketlemek için farklı boyaların kullanılması, aynı hücrelerde birden fazla mRNA türünün nicelikinin belirlenmesini kolaylaştırır. Bu deneyde, maya hücreleri alfa faktörü ve sorbitol varlığında inkübe edildi Stelara probları ile balık kullanılarak, veriler sadece kırmızı bir FUS bir başlangıç bölgesi ile gösterilen feromona yanıt veren bir hücreyi göstermektedir.

Aynı zamanda, başka bir hücre ağırlıklı olarak sorbitole yanıt verir, burada S TL bir başlangıç bölgesi yeşil olarak etiketlenir. Bu videoyu izledikten sonra, ustalaştıktan sonra mayadaki tek mRNA moleküllerini nasıl etiketleyeceğinizi ve görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik iki gün içinde düzgün bir şekilde uygulanabilir.

Yeterince yoğun bir hücre konsantrasyonuna sahip olmayı unutmayın. Seyreltik numunelerin görüntülenmesi ve saklanması için daha fazla alan gerekir.