Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekil maya hücrelerinde tek molekül özgüllüğü ile mRNA moleküllerinin varlığını saptamaktır. İlk olarak, maya hücrelerini lyase içeren tampon kullanarak formaldehit ile sabitleyin. Hücrelerin çoğu faz kontrast görünümünü kaybedene kadar geçirgenleştirme işlemini uygulayın.

Ardından, permeabilize edilmiş hücreleri floresan işaretli tek zincirli DNA molekülleri ile inkübe edin ve ardından hücreleri plazma ile temizlenmiş bir lamel üzerine monte edin. Sonuç olarak, floresan mikroskobu ile elde edilen veriler, tekil hücrelerdeki mRNA moleküllerinin varlığını ve lokalizasyonunu detaylandırabilir. Bu tekniğin gen ekspresyonu, mikro diziler ve northern blot gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil hücrelerdeki bireysel mRNA'ların görselleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, transkripsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Buna, promoter düzeyindeki regülasyon modellerine bilgi sağlayabilecek, bir popülasyondaki hücre başına düşen arm RNA sayısı miktarının belirlenmesi dahildir. Ayrıca, hücre döngüsü sırasında transkriptlerin lokalizasyonunu ve yarı ömürlerini belirlemek için de kullanılabilir.

Bir plazma temizleme vakum odasında, lamların üzerine lamel yerleştirin. Ardından vakum odasını bir mikrodalga fırına yerleştirin ve sızdırmaz olduğundan emin olun. Pompa çalıştırıldıktan sonra pompayı açın.

Vakumu açın, ardından mikrodalgayı çalıştırın ve plazma görünür hale geldikten beş saniye sonra durdurun. Daha sonra önce vakumu, ardından pompayı kapatın. Vakum odasını dışarı çıkarın.

Ardından, temizlenmiş yüzeyleri yukarı bakacak şekilde lamine camları 12 kuyucuklu plakalara aktarın; mayayı A 600 değeri yaklaşık 0.1 ile 0.2 olacak şekilde büyütün. Minimal medyumlarda, 10 mils hücre yaklaşık 10 hibridizasyon için yeterli miktar sağlar.

Büyüme besiyerine doğrudan on birimlik bir hacim %37 formaldehyde ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Hücreleri 3000 Gs'de beş dakika santrifüjleyin. Peleti bir mililitre tampon B içinde yeniden süspande edin ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bir mikro santrifüj tüpü içerisinde, buz gibi soğuk 1 mL tampon B ile iki kez yıkayın. 13,000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, 1 mL sferoid ekim tamponu ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.

Hücrelerin çoğu siyahlaşana kadar birkaç dakikada bir mikroskobik olarak izleyin. Ardından, buz gibi soğuk tamponla iki kez yıkayın. B. 3.500 RPM düşük hızda santrifüjleyin.

Bir mililitre %70 etanol resüsyonu ekleyin. Peleti nazikçe süspanse edin ve dört santigrat derecede gece boyunca bekletin veya eksi 20 santigrat derecede süresiz olarak saklayın. Hibritleşme solüsyonunu hazırlamak için, 100 mikrolitre hibritleşme tamponuna bir ila üç mikrolitre prob ekleyin.

Ardından vorteksleyiniz ve santrifüjleyiniz. Üç farklı prob seti kullanarak üç farklı geni eş zamanlı olarak görüntüledik. Şimdi, fikse edilmiş maya örneğini santrifüjleyiniz ve yıkama tamponunu aspire ederek uzaklaştırınız.

Hibridizasyon solüsyonunu ekleyin ve ertesi güne kadar 37 °C'de, hafifçe çalkalayarak karanlıkta gece boyunca inkübe edin. Temiz lamelleri beş dakika boyunca 150 µL %0,01 polilizin ile işlemden geçirin. Ardından aspire edin ve havada kurutun.

Slaytlar distile su ile üç kez yıkanır ve bir kez 1X SSC ile yıkandıktan sonra havada kurutulur. Hücreler, 150 µL 0,1 µg/mL taze hazırlanmış DAPI boyası içerisinde süspanse edilir. Hücre süspansiyonundan bir alikot polilizin işleminden geçmiş lameller üzerine damlatılır ve 30 dakika inkübe edilir. Ardından, prolong gold montaj medyumu oda sıcaklığında çözdürülür.

Bir lam üzerine üç µL yerleştirin. Ardından bir lamelle yaklaşık 0,5 mL etanol ekleyin. 12 kuyucuklu plakada, lamelleyi cımbızla tutarak kaldırın ve havada kurumaya bırakın.

Lamelin hücre tarafını montaj ortamının üzerine yerleştirin ve karanlıkta birkaç saat veya gece boyunca sertleşmeye bırakın. Kenarları oje ile mühürleyin ve görüntüleme aşamasına geçin. Referans noktası çevresinde, toplam mesafenin 5 µm ve adım boyutunun 0.2 µm olduğu bir görüntü yığını (Z-stack) alın.

Her bir prob setine karşılık gelen her bir boya kanalı için görüntülemeyi tekrarlayın. Ardından, beraberindeki metinde detaylandırıldığı şekilde işleme devam edin. Hücreleri watershed segmentasyonu ile tanımlamak için, noktaları radyal gradyan kullanarak belirleyin ve noktaları Gaussian fit ile ölçün.

Genellikle, histogramlar balık görüntülerinden hesaplanır ve tek hücrelerde bulunan mRNA sayısı belirlenmek için kullanılır. Mikroskobi tabanlı RNA miktar belirlemenin önemli bir avantajı, transkriptlerin lokalizasyonu hakkında bilgi elde edilebilmesidir. Örneğin, bu yöntem, indüklenebilir CCB CBF tek alleli ile tek hücrelerdeki mRNA'ları tanımlamak için tekil problar kullanır.

Birçok mRNA molekülü transkripsiyon bölgesinde bulunduğu için, çekirdek içindeki transkripsiyon bölgelerinin varlığını ve konumunu belirlemek kolaydır. Farklı genlerin mRNA'larını işaretlemek için farklı boyaların kullanılması, aynı hücrelerdeki birden fazla mRNA türünün miktar tayinini kolaylaştırır. Bu deneyde, maya hücreleri alfa faktör ve sorbitol varlığında inkübe edilmiştir. Stelara probları içeren balıklar kullanılarak elde edilen veriler, kırmızı bir FUS başlangıç bölgesiyle belirtilen, yalnızca feromona yanıt veren bir hücreyi göstermektedir.

Eş zamanlı olarak, başka bir hücre ağırlıklı olarak sorbitole yanıt vermektedir ve burada S TL one başlangıç bölgesi yeşil ile işaretlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, mayada tekil mRNA moleküllerinin nasıl işaretleneceği ve görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik iki gün içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir.

Hücre konsantrasyonunun yeterince yoğun olduğundan emin olun. Seyreltik örneklerin görüntülenmesi ve saklanması için daha fazla alanın taranması gerekir.