Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae

Bu prosedürün genel amacı, oksidatif strese maruz kalan mayadaki ekspresyon farklılıklarını inceleyerek lisans fen bilimleri öğrencilerine mikroarray teknolojisini tanıtmaktır. Bu, ilk olarak hidrojen peroksit ile muamele edilmiş maya kültürlerinden ve muamele edilmemiş kontrollerden toplam RNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu RNA örneklerinden CDNA oluşturmak ve saflaştırmaktır.

CDNA daha sonra in vitro transkripsiyon yoluyla CRNA etiketli biyotin hazırlamak için kullanılır. Prosedürün son adımı, AFI metrikleri maya gen çiplerine hibridizasyon için biyotin etiketli CRNA'ların parçalanmasıdır. Sonuç olarak, iki maya örneğindeki ifade farklılıklarını gösteren sonuçlar elde edilebilir ve biyoinformatik yoluyla lisans öğrencilerine mikroarray analizinin gücünü gösterir.

Vermont Genetik Ağı Sosyal Yardım ekibi, fen eğitimlerini geliştirmek için Vermont eyaletindeki fen öğrencilerine mikro ışın teknolojisi sağlamakla görevlendirildiklerinde bu yöntem için ilk kez fikir sahibi oldu. Bugüne kadar, bu yöntem eyalet genelinde sekiz bakalorya kolejinde birden fazla siteye teslim edildi. Bu nedenle, öğretim modüllerinin mikroışınını kullanmanın temel avantajı, bize laboratuvarda her gün kullanılan genel moleküler biyoloji tekniklerini bir grup bireye öğretme yeteneği vermesidir.

Ve bunu hem öğrencilere hem de öğretmenlere ve gruplarımıza öğretmek için de kullanıyoruz. Aslında aynı proje üzerinde birlikte çalışan öğrencilerimiz ve hocalarımız var. Kolay bir iş olmayan RNA'yı işlemek gibi çok fazla incelik gerektiren bazı teknikleri öğrenirler.

Görselleştirme reaktiflerini kullanarak DNA'yı nasıl çökelteceklerini öğrenirler. Aslında lisansüstü çalışmalarda veya günlük moleküler biyoloji laboratuvarlarında karşılaşacakları teknikleri kullanıyorlar. Bu yöntem oksidatif stres ve maya hakkında bilgi edinmek için uygun olsa da, bakmak isteyebileceğiniz diğer model organizmalar ve diğer biyolojik sistemler için kesinlikle uygulanabilir.

Gen ekspresyonu, gelişimsel değişiklikler, çevresel toksinler, spesifik hastalık durumları ve çok daha fazlası ile ilişkili olup olmadıklarını değiştirir. Oksidatif strese maruz kalan mayadaki ekspresyon farklılıklarını incelemek için, toplam RNA önce enzimatik liziz ile iki maya kültüründen ekstrakte edilir. Bir kültür, Hank'in tamponlu salininde 0.5 milimolar hidrojen peroksit ile bir saatlik bir muamele ile oksidatif strese maruz bırakılırken, diğer kültür kontrol olarak sadece HBSS ile muamele edildi.

İki adet 1.7 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü uygun tanımlama bilgileriyle etiketleyerek başlayın. Her tüpe 1,5 mililitre uygun maya kültürünü aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 5.000 Gs'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarmak ve atmak için bir mikro pipet kullanın. Prosedüre devam etmeden önce peletin yeterince büyük olup olmadığını kontrol edin. Pelet çok küçükse, peleti içeren aynı tüpe 1,5 mililitre kültür ekleyin ve ardından daha büyük bir pelet elde etmek için santrifüjleyin.

Süpernatanı bir mikro pipetle atın ve maya peletinden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. Daha sonra karıştırmak için maya pelet girdabına 100 mikrolitre SG tamponu ve 30 mikrolitre liase çözeltisi ekleyin. İnkübasyon sırasında her iki tüpü de oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Plakalar oluşturmak için her tüpü her 10 dakikada bir hafifçe döndürün. Mayanın sfero kaplamasını yaparken en kritik adımlardan biri, tedaviden sonra gerçekten yüzde yüz sfero plast oluşturduğunuzdan emin olmaktır. Bu, tüm litik enzimlerin eşit yaratılmadığı anlamına gelir.

Bu nedenle, iyi litik enzimin size iyi bir sfero kaplama sağladığından emin olmak için kontrol etmelisiniz, yani bu örnekleri almanız, bir mikroskop lamına koymanız ve protoplast oluşumuna sahip olduğunuzdan emin olmak için% 0.1 SDS ekleyerek mikroskop altında kontrol etmeniz gerekir. Tam sfero kaplamayı gözlemlemek için, maya hücrelerinin şişmesine ve mükemmel küreler veya sferoidler oluşturmasına neden olmak için numuneyi mikroskop altında bir mikrolitrede %0.1 SDS'de incelerken 10 mikrolitre maya numunesini bir mikroskop lamına pipetleyin. Tomurcuklanan hücrelerin de S sferoidleri oluşturduğunu gözlemlemek önemlidir.

Kısmi sfero kaplama gözlenirse, liaz ile uzun süreli bir tedavi önerilir. Her tüpe 350 mikrolitre BRLT tamponunda tam sfero kaplama onaylandıktan sonra, 250 mikrolitre %100 etanol ekleyin. Kapağı kapalı tutarak tüpün sıkıca kapatıldığından emin olun ve bir dakika boyunca kuvvetlice girdap yapın.

Bu prosedür Sphero plakalarını bitleyecektir. Bundan sonra, iki kültürden RNA'yı toplamak ve temizlemek için R ve kolay Z spin sütunlarını kullanın. Son olarak, biyotin etiketli CRNA'yı hazırlamak için elektroforez için %1.2 prekast aros jeli kullanarak ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini değerlendirin.

Maya hücrelerinden ekstrakte edilen toplam RNA, ilk olarak ters transkripsiyon ile CD NA'yı sentezlemek için kullanılır. CD NA üretiminden sonra, jelin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için CD NA çökeltme santrifüj faz kilitleme jel tüplerinde kullanılmak üzere faz kilitli jel tüplerini bir dakika boyunca tam hızda hazırlayın. pH 8.0 tris tamponlu fenil kloroform, izoamil alkol veya PCI karışımının alt tabakasının 162 mikrolitresini CD NA pipetini çökeltmek için faz kilit tüplerini girdaplamayın ve ikinci ipliğin 162 mikrolitre içeriğine ekleyin, CD NA sentez reaksiyon tüpü bu adım için eşit hacimlerde sulu ve organik karışımlar gereklidir.

İçeriği karıştırmak için beş saniye boyunca girdap. Ardından, bir mikro pipet kullanarak tüm CD N-A-P-C-I karışımını faz kilitli jel tüpüne aktarın. Faz kilitli jel tüp santrifüjünü iki dakika boyunca tam hızda girdap yapmayın.

Ardından, üst katmanı faz kilitli jel tüpünden yeni etiketlenmiş 1,7 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mikro pipet kullanın. Mümkün olduğunca çok katman toplamaya çalışın. 1.7 mililitre mikro santrifüj tüpüne, 405 mikrolitre %100 etanole, 80 mikrolitre amonyum asetata ve bir mikrolitre pelet boya girdabına aşağıdakileri ekleyin.

Tüpü, tüpün menteşesi dışarı bakacak şekilde kısa bir süre santrifüje yerleştirin ve 20 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında oda sıcaklığında, CD NA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek tüpü santrifüjden nazikçe çıkarın. Pelet, pelet boyası nedeniyle pembe olmalı ve yaklaşık olarak bir tuz tanesi büyüklüğünde olmalıdır.

Ve borunun menteşenin altındaki yan tarafına, CD NA peletini buzun üzerine yerleştirin ve hemen peleti temizlemeye devam edin. CD NA peletini temizleme prosedürüne başlamak için, tüm süpernatanı tüpten dikkatlice çıkarmak için bir P 1000 mikro pipet kullanın. Peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.

500 mikrolitre soğuk, tüpe% 80 etanol içeren numunenizdir. Tüpü nazikçe kapatın ve birkaç kez yavaşça ters çevirin. Tüpün yanından ayrılmadığından emin olmak için peletinizi çok yakından izleyin.

Pelet ayrılırsa, tüpü tekrar rafa yerleştirerek ve peletin dibe çökmesine izin vererek veya tüpü 15 saniye boyunca tam hızda santrifüjleyerek tüpün dibine geri getirebilirsiniz. Ardından, peleti bozmadan etanolü dikkatlice çıkarmak için bir P 1000 mikro pipet kullanın. Mümkün olduğu kadar fazla sıvının çıkarılmasını sağlamak için tüpü eğin.

Yeni bir Eloqua soğuk,% 80 etanol ekleyin, tüpü kapatın ve birkaç kez yavaşça ters çevirin. Bir P 1000 mikro pipet kullanarak mümkün olan tüm etanolü çıkardıktan sonra. Tüpü beş saniye boyunca tam hızda santrifüjleyin.

Ardından, peleti bozmadan son birkaç mikrolitre etanolü çıkarmak için bir P 10 mikro pipet kullanın. Kalan etanolü buharlaştırmak için açık tüpü 10 ila 20 dakika boyunca bir kurutma kutusuna yerleştirin. Pelet kuruduktan sonra kolayca kaybolur, bu nedenle tüpü nazikçe tutmaya ve kapağı kapatmaya dikkat edin.

Kurutma tamamlandığında, tüpte bulunduğunu doğrulamak için kurutulmuş peleti görselleştirin. Son olarak, kurutulmuş peleti 22 mikrolitre RNA içermeyen suda tekrar süspanse edin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Bu CDNA daha sonra Enzo BioArray kitini kullanarak in vitro transkripsiyon yoluyla CRNA etiketli biyotin hazırlamak için kullanılır.

Biyotin etiketli CRNA temizlendikten ve miktarı belirlendikten sonra, hedef hazırlama için parçalanır. CDNA oluşturulduktan sonra, biyotinile CRNA oluşturmak için standart in vitro transkripsiyon metodolojisini kullanırız. CRNA'nın mikro ışın çipine uygulanmadan önce parçalanmadan geçmesi gerekir.

Bu prosedüre başlamak için, beş mikrogram CRNA'ya eşdeğer bir miktarı etiketli 0,5 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın. Toplam hacmi 16 mikrolitreye getirmek için yeterli RNA serbest su ekleyin ve ardından tüpe dört mikrolitre beş x parçalanma tamponu ekleyin. Tüpteki toplam hacim 20 mikrolitre olmalıdır.

Tüpü girdaplayın ve 10 saniye santrifüjleyin. Daha sonra tüpü 94 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bir termocycler'da, inkübasyonun ardından tüpü buzun üzerine koyun.

Her numuneden parçalanmış ve parçalanmamış CRNA daha sonra %1.2'lik bir prekast AROS jeli kullanılarak elektroforez ile değerlendirilir. Çalışma tamamlandığında, jel bir translüminatör üzerinde görselleştirilir ve bir görüntü elde edilir. Nihai sentez ürünü, atrik maya gen çiplerine hibritlenir ve mikrodizi analizinden elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilir.

Bu ilk şekil, atrik gen çipi işletim yazılımı tarafından oluşturulan taranmış bir atrik maya gen çipi görüntüsünün bir örneğidir. Bu, tüm genetik transkriptlerin, kontrol ve tedavi edilmiş maya verilerini karşılaştıran yaklaşık 6.700 genin 2 boyutlu bir dağılım grafiğidir. Her nokta tek bir geni temsil eder.

Mor renkli genler, diferansiyel olarak ifade edilen genleri gösterirken, kırmızı renkli genler değildir. Bu örnekte, diferansiyel olarak ifade edilen genlerin çoğu, açıklamalarında belirtildiği gibi hücre döngüsü kontrolünde yer alan genlerdir. Ek açıklama görselleştirme ve entegre keşif için veritabanından alınan bu akış şeması, etkilenen bir biyolojik yolda farklı şekilde ifade edilen genleri gösterir.

Kırmızı bir yıldızla gösterilen genler, miyotik yoldaki aşağı regüle edilmiş genleri gösterir. Son olarak, coğrafi tür gen elek yazılımı kullanılarak oluşturulan bir yanardağ grafiğinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir. Kontrol ve muamele edilen numuneler, 0.05'lik bir P-değeri kesme ve 1.5 kat ifade değişikliği kesme ile karşılaştırıldı.

Maya kullanmayı seçtik çünkü mayaların hızlı bir şekilde büyümesi kolaydır, ancak aynı zamanda maya ile çalışmanın en kritik kısmının aslında iyi bir sfero kaplama oluşturmak olduğunu fark ettik. Mikroarray'de yapmak istemediğimiz şeylerden biri aslında eksik bir sindirim yapmak ve aslında sadece G bir veya G iki M fazında olan sfero plast hücreleri. Ve sonra belirli bir replikasyon aşamasında olan mayalar üzerinde bir mikroarray deneyi yapıyorsunuz.

Bu alıştırmada eve getirmeye çalıştığımız bir diğer karmaşık nokta da, CD NA insanlarının her gün bahsettiği peletlemedir, ancak bu mutlaka kolay değildir. Modülümüzde yaptığımız şey aslında özel tüpler ve görselleştirme reaktifleri kullanmak. Yani aslında DNA'yı küçültebiliriz ve temyizi görselleştirebilirsiniz, bu da hem öğrenciler hem de öğretmenler için daha kolay hale getirir.

Böylece DNA ve RNA geliştirildikten sonra tüm aşamalarda kullanılabilir. Bu modül, Bakalorya enstitülerindeki öğretim üyelerinin, muhtemelen mevcut müfredatla veya muhtemelen kendi araştırma ilgi alanlarıyla uyumlu olabilecek diğer model organizmalara veya diğer tedavi rejimlerine bakarak keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Ve size yapılan bazı modifikasyonlara bir örnek vermek gerekirse, herbisit tedavisinin maya üzerindeki etkilerini inceleyen bir site vardı veya mayada LAMP IDE tedavisine bakan başka bir site vardı, başka bir site ise özellikle ilgilendikleri bir memeli hücre hattındaki gelişimsel değişikliklere baktı.

Ve son olarak, başka bir site, diferansiyel ışık kaynaklarının arabidopsis veya bitkiler üzerindeki etkisini incelemişti. Bu videoyu izledikten sonra, toplam RNA'nın mayadan izolasyonu, CDNA'nın üretilmesi ve CRNA etiketli biyotinin parçalanması dahil olmak üzere lisans fen bilimleri öğrencileriyle bir mikroışın deneyinin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu tür üst düzey teknolojilerle ilgili uygulamalı deneyimler, lisans fen eğitimini güçlendirmeye ve güçlendirmeye yardımcı olur.