Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae

Bu prosedürün genel amacı, oksidatif strese maruz kalan mayalardaki ekspresyon farklarını inceleyerek lisans düzeyindeki fen bilimleri öğrencilerini mikroarray teknolojisiyle tanıştırmaktır. Bu işlem, öncelikle hidrojen peroksit ile işlem görmüş maya kültürlerinden ve işlem görmemiş kontrollerden toplam RNA izole edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu RNA örneklerinden cDNA üretmek ve bunları saflaştırmaktır.

Ardından, in vitro transkripsiyon yoluyla biyotin işaretli cRNA hazırlamak için cDNA kullanılır. Prosedürün son adımı, AFI metrics maya gen çiplerine hibridizasyon için biyotin işaretli cRNA'ların fragmantasyonudur. Sonuç olarak, iki maya örneğindeki ekspresyon farklarını gösteren veriler elde edilebilir ve biyoinformatik aracılığıyla lisans öğrencilerine mikroarray analizinin gücü gösterilebilir.

Vermont Genetik Ağı Erişim ekibi, bu yöntem fikrini ilk kez, bilim eğitimini geliştirmek amacıyla Vermont eyaletindeki bilim öğrencilerine mikroarray teknolojisini ulaştırmakla görevlendirildiklerinde geliştirdiler. Bugüne kadar bu yöntem, eyalet genelindeki sekiz lisans kolejinin birçok merkezinde uygulanmıştır. Dolayısıyla, öğretim modüllerinde mikroarray kullanmanın temel avantajı, laboratuvarlarda her gün kullanılan genel moleküler biyoloji tekniklerini bir gruba öğretme imkanı sunmasıdır.

Ayrıca bunu hem öğrencilere hem de öğretmenlere ve gruplarımıza eğitim vermek için kullanabiliyoruz. Hatta öğrencilerimiz ve profesörlerimiz aynı proje üzerinde birlikte çalışıyorlar. RNA ile çalışmak gibi kolay olmayan ve büyük bir hassasiyet gerektiren belirli teknikleri öğreniyorlar.

Görselleştirme reaktiflerini kullanarak DNA'yı nasıl çöktüreceklerini öğrenirler. Böylece, lisansüstü çalışmalarda veya günlük moleküler biyoloji laboratuvarlarında karşılaşacakları teknikleri fiilen kullanma imkanı bulurlar. Bu yöntem oksidatif stres ve maya hakkında bilgi edinmek için uygun olsa da, incelemek isteyebileceğiniz diğer model organizmalara ve diğer biyolojik sistemlere kesinlikle uygulanabilir.

Gelişimsel değişikliklerle, çevresel toksinlerle, spesifik hastalık durumlarıyla ve daha pek çok faktörle ilişkili olarak gen ekspresyonu değişiklikleri meydana gelir. Oksidatif strese maruz kalan mayalardaki ekspresyon farklılıklarını incelemek için, öncelikle iki maya kültüründen enzimatik lizis yoluyla toplam RNA ekstrakte edilir. Kültürlerden biri, Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 0.5 millimolar hidrojen peroksit ile bir saatlik işleme tabi tutularak oksidatif strese maruz bırakılırken, diğer kültür kontrol olarak sadece HBSS ile işleme tabi tutulmuştur.

İki adet 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü uygun tanımlama bilgileriyle etiketleyerek başlayın. Her bir tüpe 1,5 mililitre uygun maya kültürü aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, bir mikro pipet kullanarak süpernatantı, peleti rahatsız etmeden dikkatlice çekin ve atın. Prosedüre devam etmeden önce peletin yeterince büyük olduğunu kontrol edin. Pelet çok küçükse, peletin bulunduğu aynı tüpe 1,5 milliliters kültür ekleyin ve ardından daha büyük bir pelet elde etmek için santrifüjleyin.

Süpernatanı bir mikro pipet yardımıyla uzaklaştırarak maya peletindeki sıvının mümkün olduğunca fazlasını atın. Ardından maya peletine 100 µL SG tamponu ve 30 µL lyase çözeltisi ekleyip karıştırmak için vorteksleyin. Her iki tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Plaklar oluşturmak için her tüpü 10 dakikada bir hafifçe çalkalayın. Maya ile sferoplast plaklama yaparken en kritik adımlardan biri, işlem sonrası gerçekten yüzde yüz sferoplast oluşturduğunuzdan emin olmaktır. Bu durum, tüm litik enzimlerin aynı etkinlikte olmadığı anlamına gelir.

Bu nedenle, kaliteli litik enzimin başarılı bir sferoplast plağı oluşturup oluşturmadığını kontrol etmeniz gerekir; yani bu örnekleri alıp bir mikroskop lamına yerleştirmeli ve protoplast oluşumunu doğrulamak için 0.1%SDS ekleyerek mikroskop altında incelemelisiniz. Tam bir sferoplast plağı gözlemlemek için, maya hücrelerinin şişmesini sağlayarak mükemmel küreler veya sferoidler oluşturması amacıyla örneği mikroskop altında 1 µL 0.1%SDS ile incelerken, mikroskop lamına 10 µL maya örneği pipetleyin. Tomurcuklanan hücrelerin de S sferoidleri oluşturduğunu gözlemlemek önemlidir.

Kısmi sferoplast plağı gözlemlenirse, liyaz ile tedavi süresinin uzatılması önerilir. Her tüpe 350 microliters BRLT tamponu eklendiğinde tam sferoplast plağı doğrulandıktan sonra, 250 microliters %100 etanol ekleyin. Kapak kapalı tutularak tüpün sıkıca kapatıldığından emin olun ve bir dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin.

Bu prosedür Sphero plaklarını lize edecektir. Bundan sonra, iki kültürden RNA toplamak ve temizlemek için R ve easy Z spin kolonlarını kullanın. Son olarak, biyotin işaretli CRNA hazırlamak amacıyla, elektroforez için %1,2'lik hazır agaroz jel kullanarak ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini değerlendirin.

Maya hücrelerinden ekstrakte edilen toplam RNA, önce ters transkripsiyon yoluyla cDNA sentezlemek için kullanılır. cDNA üretimi sonrası, cDNA çöktürmede kullanılmak üzere phase lock jel tüplerini hazırlayın; jelin tüpün altında olduğundan emin olmak için phase lock jel tüplerini bir dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. cDNA'yı çöktürmek için phase lock tüplerini vortekslemeyin; pH 8.0 tris tamponlu fenil kloroform, izoamil alkol veya PCI karışımının alt katmanından 162 µL pipetleyin ve bunu ikinci zincir cDNA sentez reaksiyon tüpündeki 162 µL içerik ile birleştirin; bu adım için sulu ve organik karışımların eşit hacimlerde olması gerekir.

İçerikleri karıştırmak için beş saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, bir mikro pipet kullanarak tüm CD N-A-P-C-I karışımını faz kilitleme jel tüpüne aktarın. Faz kilitleme jel tüpünü vortekslemeyin; iki dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.

Ardından, faz kilitleme jel tüpündeki üst katmanı yeni etiketlenmiş 1,7 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mikro pipet kullanın. Katmanın mümkün olduğunca tamamını toplamaya çalışın. 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne şunları ekleyin: 405 mikrolitre %100 etanol, 80 mikrolitre amonyum asetat ve bir mikrolitre pellet boyası; ardından vorteksleyin.

Tüpü, menteşe kısmı dışarıya bakacak şekilde santrifüje yerleştirin ve tam hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi oda sıcaklığında tamamlandığında, CD NA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek tüpü nazikçe santrifüjden çıkarın. Pelet, pelet boyası nedeniyle pembe renkte olmalı ve yaklaşık bir tuz tanesi boyutunda olmalıdır.

Tüpün menteşe tarafına, CD NA peletini buz üzerine yerleştirin ve hemen peletin temizleme işlemine geçin. CD NA peletini temizleme prosedürüne başlamak için, tüpteki tüm süpernatanı dikkatlice uzaklaştırmak amacıyla bir P 1000 mikro pipet kullanın. Peletin bozulmamasına dikkat edin.

Tüpe 500 µL soğuk, %80 etanol ekleyin. Tüpün kapağını hafifçe kapatın ve birkaç kez yavaşça altüst edin. Peletin tüpün kenarından ayrılmadığından emin olmak için peleti çok dikkatli bir şekilde izleyin.

Pellet yerinden koparsa, tüpü tekrar rafa yerleştirip pelletin dibe çökmesini bekleyerek veya tüpü 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj ederek pelleti tekrar tüpün altına indirebilirsiniz. Ardından, pellete zarar vermeden etanolü dikkatlice çekmek için P 1000 mikropipet kullanın. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırabilmek için tüpü eğik tutun.

Yeni bir miktar soğuk, %80 etanol ekleyin, tüpün kapağını kapatın ve yavaşça birkaç kez altüst edin. P 1000 mikro pipet kullanarak mümkün olan tüm etanolü uzaklaştırdıktan sonra, tüpü beş saniye boyunca tam hızda santrifüjleyin.

Ardından, pellet'i bozmadan son birkaç mikrolitre etanolü uzaklaştırmak için P 10 mikro pipet kullanın. Kalan etanolün buharlaşması için açık tüpü 10 ila 20 dakika boyunca bir kurutma kutusuna yerleştirin. Pellet kuruduktan sonra kolayca kaybedilebilir, bu nedenle tüpü nazikçe tutmaya ve kapağını kapatmaya dikkat edin.

Kurutma işlemi tamamlandığında, tüpte bulunduğundan emin olmak için kurutulmuş pelleti gözlemleyin. Son olarak, kurutulmuş pelleti 22 µL RNA'sız suda yeniden süspande edin ve tüpü buz üzerine yerleştirin. Bu cDNA, Enzo BioArray kiti kullanılarak in vitro transkripsiyon yoluyla biotin işaretli cRNA hazırlamak için kullanılır.

Biyotinle işaretlenmiş cRNA temizlenip miktarı belirlendikten sonra, hedef hazırlığı için fragmante edilir. cDNA sentezlendiğinde, biyotinillenmiş cRNA üretmek için standart in vitro transkripsiyon metodolojisi kullanılır. cRNA, mikroarray çipine uygulanmadan önce fragmantasyon işleminden geçmelidir.

Bu prosedüre başlamak için, beş mikrogram CRNA'ya eşdeğer miktarda örneği etiketli bir 0,5 mililitre PCR tüpüne aktarın. Toplam hacmi 16 mikrolitreye tamamlamak için yeterli miktarda RNaz'dan arındırılmış su ekleyin ve ardından tüpe dört mikrolitre beş x fragmantasyon tamponu ilave edin. Tüpteki toplam hacim 20 mikrolitre olmalıdır.

Tüpü vorteksleyin ve 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Ardından tüpü 94 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Termosikletörde, inkübasyonu takiben tüpü buza yerleştirin.

Her bir örnekten elde edilen fragmente ve fragmente edilmemiş CRNA, %1,2'lik hazır dökümlü AROS jeli kullanılarak elektroforez ile değerlendirilir. Çalışma tamamlandığında, jel bir translüminatör üzerinde görüntülenir ve bir görüntü alınır. Nihai sentez ürünü, atrik maya gen çiplerine hibridize edilir ve mikroarray analizinden elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmektedir.

Bu ilk şekil, atrics gen çipi çalışma yazılımı tarafından oluşturulmuş taranmış bir atrics maya gen çipi görüntüsü örneğidir. Bu, kontrol ve işlem görmüş maya verilerini karşılaştıran, yaklaşık 6.700 geni içeren tüm genetik transkriptlerin 2B dağılım grafiğidir. Her nokta tek bir geni temsil etmektedir.

Mor renkle belirtilen genler farklı şekilde ifade edilen genleri, kırmızı renkle belirtilenler ise öyle olmayanları göstermektedir. Bu örnekte, açıklamalarından da anlaşıldığı üzere, farklı şekilde ifade edilen genlerin çoğu hücre döngüsü kontrolünde yer alan genlerdir. Anotasyon görselleştirme ve entegre keşif veritabanından alınan bu akış şeması, etkilenmiş bir biyolojik yolaktaki farklı şekilde ifade edilen genleri örneklendirmektedir.

Kırmızı yıldızla belirtilen genler, miyotik yolaktaki aşağı regüle edilmiş genleri göstermektedir. Son olarak, geo species gene sifter yazılımı kullanılarak oluşturulan bir volkan grafiğinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Kontrol ve işlem görmüş örnekler, 0,05 P-değeri eşiği ve 1,5 kat ekspresyon değişim eşiği ile karşılaştırılmıştır.

Mayaların hızlı ve kolay şekilde büyütülmesi nedeniyle onları kullanmayı tercih ettik, ancak mayalarla çalışırken en kritik kısmın aslında düzgün bir sferoplast plaklama oluşturmak olduğunu fark ettik. Mikroarray çalışmasında yapmak istemediğimiz şeylerden biri, eksik bir sindirim gerçekleştirip yalnızca G1 veya G2 M fazındaki sferoplast hücrelerini elde etmektir. Bu durumda, belirli bir replikasyon fazında olan mayalar üzerinde bir mikroarray deneyi yapmış olursunuz.

Bu çalışmada vurgulamaya çalıştığımız bir diğer karmaşık nokta, herkesin her gün bahsettiği DNA çöktürme işleminin aslında her zaman kolay olmadığıdır. Modülümüzde, DNA'yı çöktürebilmek ve çökeleği görünür kılmak için özel tüpler ve görüntüleme reaktifleri kullandık; böylece hem öğrenciler hem de öğretmenler için süreç daha kolay hale getirilmiştir.

Böylece, geliştirilmesinin ardından DNA ve RNA çalışmalarının tüm aşamalarında kullanılabilir. Bu modül, lisans eğitim kurumlarındaki öğretim üyelerinin; mevcut müfredatla veya kendi araştırma ilgi alanlarıyla uyumlu olabilecek diğer model organizmaları veya farklı tedavi rejimlerini keşfetmelerine gerçekten ön ayak olmuştur. Yapılan bazı modifikasyonlara örnek vermek gerekirse; bir merkez maya üzerinde herbisit uygulamasının etkilerini, bir diğeri maya üzerinde LAMP IDE uygulamasını, bir başka merkez ise özellikle ilgilendikleri bir memeli hücre hattındaki gelişimsel değişiklikleri incelemiştir.

Ve son olarak, bir başka çalışma farklı ışık kaynaklarının arabidopsis veya bitkiler üzerindeki etkisini incelemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, mayadan toplam RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve biotin işaretli cRNA fragmantasyonu dahil olmak üzere, lisans düzeyindeki fen bilimleri öğrencileriyle bir mikro dizi deneyi kurulumunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu tür ileri düzey teknolojilerle edinilen uygulamalı deneyimler, lisans bilim eğitimini pekiştirmeye ve güçlendirmeye yardımcı olur.