Name: Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Öğrenin, mikrodizi teknolojisi ile Saccharomyces cerevisiae'de oksidatif strese bağlı gen ekspresyonu değişikliklerini analiz etmeyi. Bu yöntem, lisans öğrencilerine biyoinformatik ve moleküler biyoloji tekniklerini uygulamalı olarak öğretir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Vermont Üniversitesi, Vermont Genetik Ağ. Bu yayın BRIN Programı ve Hibe Numarası P20 RR16462 theNational Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) bir bileşeni INBRE Programı Hibe sayısı P20 RR16462 Vermont Genetik Network aracılığıyla mümkün olmuştur . Kitabın içeriği, sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NCRR veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz bu modül Castleton State College, Green Mountain Koleji, Johnson State College, Lyndon State College, Marlboro Koleji, Middlebury Koleji, Norwich Üniversitesi ve Saint Michael College rafine işbirliği ve giriş için tüm katılımcı sosyal yardım kurumları teşekkür etmek istiyorum.</p&gt;

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).</li>
<li>Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+responses+to+oxidative+stress+impact+upon+multiple+levels+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis.</a> J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).</li>
<li>Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H2O2+stimulon+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).</li>
<li>Vermont Genetics Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microarray+Outreach%22">Microarray Outreach</a>. , (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Affymetrix+GeneChip+Expression+Analysis%3A+Technical+Manual%22">Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual</a>. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

Bu video-makale üretim EMD-Millipore sponsor oldu.

<p class="jove_step"&gt; Uygulamalar ve önemi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vermont Genetik Ağ tanıtım programı, Vermont Üniversitesi, eyalet çapında sekiz ortak lisans kolej lisans sosyal yürütmektedir. VGN Sosyal Yardım Core hedefi Vermont eyaletinde ellerini kullanarak deneyimleri-state-of-the-art bilimsel teknoloji ve kaynakları lisans maruz. 2003 yılında açıklanan mikroarray modülü geliştirdi ve daha sonra yükseltildi. Mini bir ders olarak sunulan veya katılan kurumlarda mevcut laboratuvar müfredat içine entegre edilmiştir.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Bu proje, araştırma, üniversite çekirdek ve yüksek lisans kolej arasında, eğitim ve araştırma işbirliklerini teşvik etmektedir. Mikroarray yardım boyunca devlet müfredat geliştirilmiş ve çekirdek tesisleri, öğretim üyeleri ve öğrenciler için araştırma ve ağ fırsatları yarattı.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Lisans öğretim programı benimsemek gibi uygun Affymetrix GeneChips ve ek açıklama vardır sağlanan eşsiz deneyler tasarlamak için teşvik edilir. Laboratuvar kılavuzu, referanslar ve PowerPoint sunumları da dahil olmak üzere bu modül için tüm bilgiler online (Vermont Genetik Network, 2008).</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Kritik adımları izleyin:</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Spheroplasting:</em&gt; Mikroskop altında başarılı spheroplasting gözlemlemek önemlidir. Parçacıklarının sonuçlanan maya şişmesine neden olur SDS kullanımı son derece faydalıdır. Tomurcuklanan hücreleri de parçacıklarının formu gözlemlemek önemlidir. Kısmi spheroplasting görülürse lyticase ile uzun bir tedavi tavsiye edilir.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Pelet temizleme:</em&gt; Yağış reaksiyon ve bunu takip eden etanol yıkama sırasında, cDNA pelet kaybetmek çok kolaydır. Pelet çok dikkatli ve titiz dikkat zorunludur.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Membran merkezine su uygulamak:</em&gt; Membran RNA elüsyon adım sırasında, suyun doğrudan silika membran merkezine 30 ul &quot;squirt&quot; için önemlidir. Bu başarılı değilse, sütun santrifüj ve çıkan elutant silika membran tekrar tekrar uygulanan olabilir. Bu gerekli olduğu birçok kez tekrarlanabilir.</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Modifikasyon ve Ürün Oyuncu Değişikliği:</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Alternatif RNA temiz-up sütunlar ikame edilebilir. Örneğin, USB hazırlık kolaylığı ve Invitrogen Saf Link RNA kiti ve birkaç isim Omega RNA temizleme kiti.</li&gt;<li&gt; Schizosaccharomyces pombe isteğe bağlı bir maya. Affymetrix GeneChip aynı yonga üzerinde hem genomların</li&gt;<li&gt; Çeşitli tedaviler ve saatler kullanılıyor olabilir. Bu ilaç tedavileri, sıcaklık tedavileri, anti-oksidanlar, vb Tedavi kez de ayarlanmış olabilir içerebilir.</li&gt;<li&gt; DNaz tedavi yöntemleri Oligo (dT) astar kullanımı açıklanan istihdam çünkü gerekli olmayabilir.</li&gt;<li&gt; Aynı 30 ul kısım sütun kapalı RNA çift elüsyon gerçekleştirmek için gerekli değildir. Bir kere hemen hemen her zaman yeterli olmaktadır. Bu, tam bir iyileşme elde edilir olmasını sağlamak için tavsiye edilir. Ayrıca, sütun RNA Zehir kullanılan su 65 Önceden ısıtılmış ° C daha fazla silis sütun RNA kurtarmak için yeteneklerini geliştirmek.</li&gt;<li&gt; RNA ölçmek için pek çok yöntem mevcuttur. Eppendorf ve Nanodrop sadece kullanım kolaylığı için seçilen ve doğruluğu test edilmiştir.</li&gt;<li&gt; Agaroz jel elektroforezi birçok standart laboratuar ekipmanları kullanılarak yapılabilir. E-Gel gerekli ama RNaz ücretsiz ve jel katılaşma bekleme süresi gerektirmez, çünkü arzu değildir.</li&gt;<li&gt; Ürünler için Sipariş bilgileri temin edilmiştir. Ancak, birçok genel reaktifler birden çok tedarikçiden sipariş edilebilir.</li&gt;<liDaha az maliyetlidir&gt; Bir Döngüsü cDNA reaktifleri ayrı ayrı satın alınabilir.</li&gt;<li&gt; Diğer hedef hazırlık yöntemlerdir, ancak bu bir öğrenci için daha fazla eğitim fırsatları sunmaktadır.</li&gt;</ol&gt;

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Genel Laboratuvar Cihazları</strong</td<td<strong&gt; Şirket</strong</td<td<strong&gt; Ürün numarası</strong</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Spetrophotometer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocyler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mikrosantrifüj</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vortex</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Stir Tabaklar (2)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-10s Pipet</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-20 Pipet:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-200 Pipet:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-1000 Pipet:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kamera ve transilluminator&#39;de</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Sarf Malzemeleri - tavsiye</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Jel Aparatı</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6000-08</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Jeller</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6018-02</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 1,7 ml. Açık</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT175C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 0.5 ml açık tüpler</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT060C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 2ml yakalama tüpler</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT200NC</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-10 ART ipuçları kutuları:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT10XL</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kutular P-100 SANAT ipuçları:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT200</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kutular P-20 ART ipuçları:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT20</td</tr&gt;<tr&gt;<tdP-1000 SANAT İpuçları&gt; Kutular:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT1000</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Maya Chips</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Genel Laboratuvar Malzemeleri</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 25 ml steril tek kullanımlık pipetler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5ml steril tek kullanımlık pipetler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mikrofuge&#39;de tüp rafları</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kimwipes:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lab Coats</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Barlar karıştırın</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kültür matara</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Innoculating döngüler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sharpies</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Eldiven</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Otoklav bandı</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Karıştırıcı bar</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktifler</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;% 30 Hidrojen Peroksit</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-386790?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 386.790</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ca, Mg olmadan HBSS veya boya</td<td&gt; Sigma-Aldrich</td<td&gt; H6648-100ml</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen Rneasy Mini Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 74.104</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen DNaz Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 79.254</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Rnase Remover</td<td&gt; Denville Bilimsel</td<td&gt; D1180</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Harleco Alcohol% 100</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/harleco-alcohol/EMD_CHEM-65347/p_uuid?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 65.347</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ENZO IVT Seti</td<td&gt; ENZO</td<td&gt; ENZ-42655-10</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lyticase: Bir şişe</td<td&gt; VWR</td<td&gt; IC19012310</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Su, Hücre Kültürü notu</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4.86505?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,86505</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Maya kültürü:</td<td&gt; ATCC</td<td&gt; 18.824</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YPD suyu tozu</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/products/EMD_CHEM-4.85040?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,8504</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; D (+) Glikoz, Susuz</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-346351?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 346.351</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sorbitol</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-56755?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 56.755</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EDTA</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4005?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4005</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SDS çözeltisi,% 20</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-7990-OP?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 7990-OP</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pelet Boya</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69049?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69.049</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCI RNaz DNaz bedava (7 alikotları):</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; AC32711-500</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7.5 Milyon NH4OAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; ICN1987 5980</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Parçalanma Tampon (200 mM Tris-asetat, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Trizma Base</td<td&gt; Fiaher</td<td&gt; 50-899-90034</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KOAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9757725</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgOA</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9681042</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Yükleme Boya</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; 10482055</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCR Belirteçleri</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69278-3?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69.278-3</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Faz Kilit Jeller</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; FP2302820</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bir Döngüsü cDNA Kit</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; A10752-030</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Içerir;</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. coli DNA Pol</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNTP</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T4 DNA Pol.</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T-7 oligod (T)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0.5 ml EDTA, pH 8.0</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; İlk Strand Tampon</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. Coli RNaseH</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; İkinci Strand Tampon</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. Coli DNA ligaz</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Üst Simge II.</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DTT</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

mikroarray analizi için saccharomyces cerevisiae</em

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Hidrojen peroksit (H 2 O 2), ek bir oksitleyici ajan tarafından indüklenen oksidatif strese maruz kaldıktan sonra bu protokol, maya (Saccharomyces cerevisiae) gen ekspresyonu değiştirildi. Deneyde, maya, 3X glikoz içeren 1/2X YPD suyu 48 saat boyunca yetiştirilir. Kültür, bir kontrol ve tedavi edilen grup bölünür. 1 saat süreyle deney kültür 0.5 mM Hanks de H 2 O 2 ile tedavi edilir (HBSS) Tuzlu Tamponlu. Kontrol kültürü sadece HBSS ile tedavi edilir. Total RNA, her iki kültürde elde edilir ve çok adımlı bir süreç boyunca bir biotin etiketli Crna ürün dönüştürülür. Nihai sentez ürünü UVM Mikroarray Core Tesis için geri alınır ve Affymetrix maya GeneChips melezleşmiştir. Sonuçta elde edilen gen ekspresyon verileri biyoinformatik veri analiz yazılımı yüklenir.

Bu protokol, maya gen ekspresyonu (<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;) Değiştirildi hidrojen peroksit (H eklenmesi ile indüklenen oksidatif strese maruz kaldıktan sonra<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;), Oksitleyici ajan.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Bu protokolde, hidrojen eklenmesiyle tetiklenen oksidatif strese maruz bırakıldıktan sonra mayadaki (Saccharomyces cerevisiae) gen ifadesi değiştirilir...

Bu prosedürün genel amacı, oksidatif strese maruz kalan mayalardaki ekspresyon farklarını inceleyerek lisans düzeyindeki fen bilimleri öğrencilerini mikroarray teknolojisiyle tanıştırmaktır. Bu işlem, öncelikle hidrojen peroksit ile işlem görmüş maya kültürlerinden ve işlem görmemiş kontrollerden toplam RNA izole edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu RNA örneklerinden cDNA üretmek ve bunları saflaştırmaktır.Ardından, in vitro transkripsiyon yoluyla biyotin işaretli cRNA hazırlamak için cDNA kullanılır. Prosedürün son adımı, AFI metrics maya gen çiplerine hibridizasyon için biyotin işaretli cRNA'ların fragmantasyonudur. Sonuç olarak, iki maya örneğindeki ekspresyon farklarını gösteren veriler elde edilebilir ve biyoinformatik aracılığıyla lisans öğrencilerine mikroarray analizinin gücü gösterilebilir.Vermont Genetik Ağı Erişim ekibi, bu yöntem fikrini ilk kez, bilim eğitimini geliştirmek amacıyla Vermont eyaletindeki bilim öğrencilerine mikroarray teknolojisini ulaştırmakla görevlendirildiklerinde geliştirdiler. Bugüne kadar bu yöntem, eyalet genelindeki sekiz lisans kolejinin birçok merkezinde uygulanmıştır. Dolayısıyla, öğretim modüllerinde mikroarray kullanmanın temel avantajı, laboratuvarlarda her gün kullanılan genel moleküler biyoloji tekniklerini bir gruba öğretme imkanı sunmasıdır.Ayrıca bunu hem öğrencilere hem de öğretmenlere ve gruplarımıza eğitim vermek için kullanabiliyoruz. Hatta öğrencilerimiz ve profesörlerimiz aynı proje üzerinde birlikte çalışıyorlar. RNA ile çalışmak gibi kolay olmayan ve büyük bir hassasiyet gerektiren belirli teknikleri öğreniyorlar.Görselleştirme reaktiflerini kullanarak DNA'yı nasıl çöktüreceklerini öğrenirler. Böylece, lisansüstü çalışmalarda veya günlük moleküler biyoloji laboratuvarlarında karşılaşacakları teknikleri fiilen kullanma imkanı bulurlar. Bu yöntem oksidatif stres ve maya hakkında bilgi edinmek için uygun olsa da, incelemek isteyebileceğiniz diğer model organizmalara ve diğer biyolojik sistemlere kesinlikle uygulanabilir.Gelişimsel değişikliklerle, çevresel toksinlerle, spesifik hastalık durumlarıyla ve daha pek çok faktörle ilişkili olarak gen ekspresyonu değişiklikleri meydana gelir. Oksidatif strese maruz kalan mayalardaki ekspresyon farklılıklarını incelemek için, öncelikle iki maya kültüründen enzimatik lizis yoluyla toplam RNA ekstrakte edilir. Kültürlerden biri, Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 0.5 millimolar hidrojen peroksit ile bir saatlik işleme tabi tutularak oksidatif strese maruz bırakılırken, diğer kültür kontrol olarak sadece HBSS ile işleme tabi tutulmuştur.İki adet 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü uygun tanımlama bilgileriyle etiketleyerek başlayın. Her bir tüpe 1,5 mililitre uygun maya kültürü aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, bir mikro pipet kullanarak süpernatantı, peleti rahatsız etmeden dikkatlice çekin ve atın. Prosedüre devam etmeden önce peletin yeterince büyük olduğunu kontrol edin. Pelet çok küçükse, peletin bulunduğu aynı tüpe 1,5 milliliters kültür ekleyin ve ardından daha büyük bir pelet elde etmek için santrifüjleyin.Süpernatanı bir mikro pipet yardımıyla uzaklaştırarak maya peletindeki sıvının mümkün olduğunca fazlasını atın. Ardından maya peletine 100 µL SG tamponu ve 30 µL lyase çözeltisi ekleyip karıştırmak için vorteksleyin. Her iki tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Plaklar oluşturmak için her tüpü 10 dakikada bir hafifçe çalkalayın. Maya ile sferoplast plaklama yaparken en kritik adımlardan biri, işlem sonrası gerçekten yüzde yüz sferoplast oluşturduğunuzdan emin olmaktır. Bu durum, tüm litik enzimlerin aynı etkinlikte olmadığı anlamına gelir.Bu nedenle, kaliteli litik enzimin başarılı bir sferoplast plağı oluşturup oluşturmadığını kontrol etmeniz gerekir; yani bu örnekleri alıp bir mikroskop lamına yerleştirmeli ve protoplast oluşumunu doğrulamak için 0.1%SDS ekleyerek mikroskop altında incelemelisiniz. Tam bir sferoplast plağı gözlemlemek için, maya hücrelerinin şişmesini sağlayarak mükemmel küreler veya sferoidler oluşturması amacıyla örneği mikroskop altında 1 µL 0.1%SDS ile incelerken, mikroskop lamına 10 µL maya örneği pipetleyin. Tomurcuklanan hücrelerin de S sferoidleri oluşturduğunu gözlemlemek önemlidir.Kısmi sferoplast plağı gözlemlenirse, liyaz ile tedavi süresinin uzatılması önerilir. Her tüpe 350 microliters BRLT tamponu eklendiğinde tam sferoplast plağı doğrulandıktan sonra, 250 microliters %100 etanol ekleyin. Kapak kapalı tutularak tüpün sıkıca kapatıldığından emin olun ve bir dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin.Bu prosedür Sphero plaklarını lize edecektir. Bundan sonra, iki kültürden RNA toplamak ve temizlemek için R ve easy Z spin kolonlarını kullanın. Son olarak, biyotin işaretli CRNA hazırlamak amacıyla, elektroforez için %1,2'lik hazır agaroz jel kullanarak ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini değerlendirin.Maya hücrelerinden ekstrakte edilen toplam RNA, önce ters transkripsiyon yoluyla cDNA sentezlemek için kullanılır. cDNA üretimi sonrası, cDNA çöktürmede kullanılmak üzere phase lock jel tüplerini hazırlayın; jelin tüpün altında olduğundan emin olmak için phase lock jel tüplerini bir dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. cDNA'yı çöktürmek için phase lock tüplerini vortekslemeyin; pH 8.0 tris tamponlu fenil kloroform, izoamil alkol veya PCI karışımının alt katmanından 162 µL pipetleyin ve bunu ikinci zincir cDNA sentez reaksiyon tüpündeki 162 µL içerik ile birleştirin; bu adım için sulu ve organik karışımların eşit hacimlerde olması gerekir.İçerikleri karıştırmak için beş saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, bir mikro pipet kullanarak tüm CD N-A-P-C-I karışımını faz kilitleme jel tüpüne aktarın. Faz kilitleme jel tüpünü vortekslemeyin; iki dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.Ardından, faz kilitleme jel tüpündeki üst katmanı yeni etiketlenmiş 1,7 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mikro pipet kullanın. Katmanın mümkün olduğunca tamamını toplamaya çalışın. 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne şunları ekleyin: 405 mikrolitre %100 etanol, 80 mikrolitre amonyum asetat ve bir mikrolitre pellet boyası; ardından vorteksleyin.Tüpü, menteşe kısmı dışarıya bakacak şekilde santrifüje yerleştirin ve tam hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi oda sıcaklığında tamamlandığında, CD NA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek tüpü nazikçe santrifüjden çıkarın. Pelet, pelet boyası nedeniyle pembe renkte olmalı ve yaklaşık bir tuz tanesi boyutunda olmalıdır.Tüpün menteşe tarafına, CD NA peletini buz üzerine yerleştirin ve hemen peletin temizleme işlemine geçin. CD NA peletini temizleme prosedürüne başlamak için, tüpteki tüm süpernatanı dikkatlice uzaklaştırmak amacıyla bir P 1000 mikro pipet kullanın. Peletin bozulmamasına dikkat edin.Tüpe 500 µL soğuk, %80 etanol ekleyin. Tüpün kapağını hafifçe kapatın ve birkaç kez yavaşça altüst edin. Peletin tüpün kenarından ayrılmadığından emin olmak için peleti çok dikkatli bir şekilde izleyin.Pellet yerinden koparsa, tüpü tekrar rafa yerleştirip pelletin dibe çökmesini bekleyerek veya tüpü 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj ederek pelleti tekrar tüpün altına indirebilirsiniz. Ardından, pellete zarar vermeden etanolü dikkatlice çekmek için P 1000 mikropipet kullanın. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırabilmek için tüpü eğik tutun.Yeni bir miktar soğuk, %80 etanol ekleyin, tüpün kapağını kapatın ve yavaşça birkaç kez altüst edin. P 1000 mikro pipet kullanarak mümkün olan tüm etanolü uzaklaştırdıktan sonra, tüpü beş saniye boyunca tam hızda santrifüjleyin.Ardından, pellet'i bozmadan son birkaç mikrolitre etanolü uzaklaştırmak için P 10 mikro pipet kullanın. Kalan etanolün buharlaşması için açık tüpü 10 ila 20 dakika boyunca bir kurutma kutusuna yerleştirin. Pellet kuruduktan sonra kolayca kaybedilebilir, bu nedenle tüpü nazikçe tutmaya ve kapağını kapatmaya dikkat edin.Kurutma işlemi tamamlandığında, tüpte bulunduğundan emin olmak için kurutulmuş pelleti gözlemleyin. Son olarak, kurutulmuş pelleti 22 µL RNA'sız suda yeniden süspande edin ve tüpü buz üzerine yerleştirin. Bu cDNA, Enzo BioArray kiti kullanılarak in vitro transkripsiyon yoluyla biotin işaretli cRNA hazırlamak için kullanılır.Biyotinle işaretlenmiş cRNA temizlenip miktarı belirlendikten sonra, hedef hazırlığı için fragmante edilir. cDNA sentezlendiğinde, biyotinillenmiş cRNA üretmek için standart in vitro transkripsiyon metodolojisi kullanılır. cRNA, mikroarray çipine uygulanmadan önce fragmantasyon işleminden geçmelidir.Bu prosedüre başlamak için, beş mikrogram CRNA'ya eşdeğer miktarda örneği etiketli bir 0,5 mililitre PCR tüpüne aktarın. Toplam hacmi 16 mikrolitreye tamamlamak için yeterli miktarda RNaz'dan arındırılmış su ekleyin ve ardından tüpe dört mikrolitre beş x fragmantasyon tamponu ilave edin. Tüpteki toplam hacim 20 mikrolitre olmalıdır.Tüpü vorteksleyin ve 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Ardından tüpü 94 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Termosikletörde, inkübasyonu takiben tüpü buza yerleştirin.Her bir örnekten elde edilen fragmente ve fragmente edilmemiş CRNA, %1,2'lik hazır dökümlü AROS jeli kullanılarak elektroforez ile değerlendirilir. Çalışma tamamlandığında, jel bir translüminatör üzerinde görüntülenir ve bir görüntü alınır. Nihai sentez ürünü, atrik maya gen çiplerine hibridize edilir ve mikroarray analizinden elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmektedir.Bu ilk şekil, atrics gen çipi çalışma yazılımı tarafından oluşturulmuş taranmış bir atrics maya gen çipi görüntüsü örneğidir. Bu, kontrol ve işlem görmüş maya verilerini karşılaştıran, yaklaşık 6.700 geni içeren tüm genetik transkriptlerin 2B dağılım grafiğidir. Her nokta tek bir geni temsil etmektedir.Mor renkle belirtilen genler farklı şekilde ifade edilen genleri, kırmızı renkle belirtilenler ise öyle olmayanları göstermektedir. Bu örnekte, açıklamalarından da anlaşıldığı üzere, farklı şekilde ifade edilen genlerin çoğu hücre döngüsü kontrolünde yer alan genlerdir. Anotasyon görselleştirme ve entegre keşif veritabanından alınan bu akış şeması, etkilenmiş bir biyolojik yolaktaki farklı şekilde ifade edilen genleri örneklendirmektedir.Kırmızı yıldızla belirtilen genler, miyotik yolaktaki aşağı regüle edilmiş genleri göstermektedir. Son olarak, geo species gene sifter yazılımı kullanılarak oluşturulan bir volkan grafiğinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Kontrol ve işlem görmüş örnekler, 0,05 P-değeri eşiği ve 1,5 kat ekspresyon değişim eşiği ile karşılaştırılmıştır.Mayaların hızlı ve kolay şekilde büyütülmesi nedeniyle onları kullanmayı tercih ettik, ancak mayalarla çalışırken en kritik kısmın aslında düzgün bir sferoplast plaklama oluşturmak olduğunu fark ettik. Mikroarray çalışmasında yapmak istemediğimiz şeylerden biri, eksik bir sindirim gerçekleştirip yalnızca G1 veya G2 M fazındaki sferoplast hücrelerini elde etmektir. Bu durumda, belirli bir replikasyon fazında olan mayalar üzerinde bir mikroarray deneyi yapmış olursunuz.Bu çalışmada vurgulamaya çalıştığımız bir diğer karmaşık nokta, herkesin her gün bahsettiği DNA çöktürme işleminin aslında her zaman kolay olmadığıdır. Modülümüzde, DNA'yı çöktürebilmek ve çökeleği görünür kılmak için özel tüpler ve görüntüleme reaktifleri kullandık; böylece hem öğrenciler hem de öğretmenler için süreç daha kolay hale getirilmiştir.Böylece, geliştirilmesinin ardından DNA ve RNA çalışmalarının tüm aşamalarında kullanılabilir. Bu modül, lisans eğitim kurumlarındaki öğretim üyelerinin; mevcut müfredatla veya kendi araştırma ilgi alanlarıyla uyumlu olabilecek diğer model organizmaları veya farklı tedavi rejimlerini keşfetmelerine gerçekten ön ayak olmuştur. Yapılan bazı modifikasyonlara örnek vermek gerekirse; bir merkez maya üzerinde herbisit uygulamasının etkilerini, bir diğeri maya üzerinde LAMP IDE uygulamasını, bir başka merkez ise özellikle ilgilendikleri bir memeli hücre hattındaki gelişimsel değişiklikleri incelemiştir.Ve son olarak, bir başka çalışma farklı ışık kaynaklarının arabidopsis veya bitkiler üzerindeki etkisini incelemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, mayadan toplam RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve biotin işaretli cRNA fragmantasyonu dahil olmak üzere, lisans düzeyindeki fen bilimleri öğrencileriyle bir mikro dizi deneyi kurulumunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu tür ileri düzey teknolojilerle edinilen uygulamalı deneyimler, lisans bilim eğitimini pekiştirmeye ve güçlendirmeye yardımcı olur.

microarray-analysis-for-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, RNA-seq S. cerevisiae hücre hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri izlemek için bir iletişim kuralı'nı mevcut. Bu yöntem gen ekspresyonu herhangi bir hücresel yanıt sırasında analiz etmek için adapte edilebilir.

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Sıralama (RH-seq) ile karşılıklı hemizygosity türler arasındaki bir özellik farkıgenetik temelharita için güçlü bir yeni yöntemdir. Hemizygot havuzları transposon mutagenezi tarafından oluşturulur ve fitness yüksek sıralama boyunca kullanarak rekabetçi büyüme ile izlenir. Elde edilen verilerin analizi, özelliğin altında yatan genleri saptar.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Mikrobiyal mühendisliğin 'tasarım-yap-test' döngüsündeki bir darboğaz, suşların işlevsel ekranlarını gerçekleştirebildiğimiz hızdır. Damlacık bazlı RNA dizilimi kullanan deney başına yüzlerce ila binlerce maya hücresine uygulanan gerinim taraması için yüksek iş letme yöntemini tanımlıyoruz.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Öğrenin, mikrodizi teknolojisi ile Saccharomyces cerevisiae'de oksidatif strese bağlı gen ekspresyonu değişikliklerini analiz etmeyi. Bu yöntem, lisans öğrencilerine biyoinformatik ve moleküler biyoloji tekniklerini uygulamalı olarak öğretir.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae

Daha fazla video keşfet