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쥐의 비침습성 ACL 손상 후 무릎 관절 퇴행 시각화
 
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쥐의 비침습성 ACL 손상 후 무릎 관절 퇴행 시각화

Overview

출처: 린지 K. 레플리1,2,스티븐 M. 다비1,티모시 A. 버터필드3,4, 시나 샤바즈모하마디5,

1 코네티컷 대학교, 스토스, CT, 운동학학과; 2 정형 외과학과, 코네티컷 보건 센터의 대학, 파밍턴, CT; 3 재활 과학학과, 켄터키 대학, 렉싱턴, 켄터키; 4 근육 생물학 센터, 생리학과, 켄터키 대학, 렉싱턴, 켄터키; 5 생물 의학 공학 과, 코네티컷 대학, 스토스, CT

전방 십자 인대 (ACL) 무릎부상은 극적으로 외상 후 골관절염의 위험을 증가 (PTOA), 개인의 약 1/3A는 ACL 부상 후 첫 10 년 이내에 방사선 PTOA를 시연 할 것이다. ACL 재건 (ACLR)이 성공적으로 무릎 관절 안정성을 복원하지만, ACLR 및 현재 재활 기술은 PTOA의 발병을 방지하지 않습니다. 따라서, ACL 상해는 외상성 합동 상해 후에 PTOA의 발달을 공부하는 이상적인 모형을 나타냅니다.

쥐 모델은 PTOA에 ACL 부상의 발병과 효과를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. ACL 상해의 가장 널리 이용된 모형은 ACL 편부입니다, 외과적으로 합동을 불안정하게 하는 심각한 모형입니다. 실용적이지만,이 모델은 부상에 대한 원주민 생물학적 반응을 가리는 침습적 및 비 생리적 상해 절차로 인해 인체 ACL 부상을 충실하게 모방하지 는 않습니다. 결과의 임상 번역을 개선하기 위해, 우리는 최근에 ACL이 단 한 번의 정골 압축 부하를 통해 파열되는 ACL 상해의 새로운 비침습적 모델을 개발했습니다. 이 부상은 밀접하게 인간과 관련된 부상 조건을 복제하고 매우 재현할 수 있습니다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT)을 통한 조인트 변성의 시각화는 전체 조인트 변성의 신속하고 고해상도, 비파괴3D 이미징을 포함한 기존의 OA 염색 기술에 대한 몇 가지 주요 발전을 제공합니다. 이 데모의 목적은 설치류 모델에서 비침습적 ACL 부상의 상태를 도입하고 μCT를 사용하여 무릎 관절 변성을 정량화하는 것입니다.

Principles

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ACL은 경골의 전방 간관 공간에서 발생 하 고 대퇴골의 측면 응다의 후면 측면에 우수 하 고 측면으로 확장 하는 조밀 한 결합 조직의 대역 같은 구조. 구조적으로, ACL은 무릎의 수동 안정제 역할을, 동적 운동 동안 관절을 제어하는 데 도움이 다른 인대뿐만 아니라 허벅지 근육과 함께 작업. ACL은 전방 경골 변위의 주요 구속이며 무릎 관절 안정성을 유지하는 데 필수적인 역할을합니다. 구조적 지원을 넘어, ACL은 또한 무릎 관절과 중추 신경계 사이의 신경 정보를위한 경로 역할을합니다. ACL에 가장 큰 스트레스는 무릎이 연장 에 가까운 때 발생, 그리고 ACL부상의 가장 높은 위험에이 시간 동안.

ACL은 스포츠 와 작업 관련 활동 중 가장 일반적으로 부상 무릎 인대입니다. 비접촉 ACL 부상은 모든 ACL 부상의 거의 70 %를 차지하며, 사람이 ACL의 과도한 로딩으로 이어지는 무릎에 충분한 힘 및 / 또는 순간을 생성 할 때 발생합니다. 비접촉 ACL 부상의 메커니즘은 다양한 연구 모델 (예비, 회고, 관찰, 생체시험관 내)을사용하여 조사되었지만 부상이 어떻게 발생하는지에 대한 직접적인 결정은 여전히 애매합니다. ACL 재건은 종종 ACL의 영역에 개별 햄스트링 또는 슬개골 힘줄의 일부를 외과적으로 삽입하여 수행됩니다. 외과 재건의 목적은 무릎 안정성과 부상 후 잃어버린 기능 적 용량을 극대화하는 것입니다. 외과 재건은 스포츠에 안전한 복귀를 용이하게하고 장기 무릎 관절 건강을 촉진. 그러나, 임상의와 연구원의 최선의 노력에도 불구하고, 재건 된 ACL을 가진 환자의 거의 3 분의 2는 재건 후 12 개월에 활동으로 돌아오지 않으며 ACL 재건 무릎의 50 % 이상이 부상 후 PTOA 5-14 년의 방사선 징후를 가지고 있습니다.

동물 모델은 관절 건강에 대한 치료의 자연사와 반응을 연구하는 실용적이고 임상적으로 관련된 방법을 제공합니다. 중요한 것은 쥐의 무릎은 유사한 해부학과 인간에서 무릎에 기능을 가지고, 이는 쥐 무릎 ACL 부상 후 PTOA를 공부하는 유용한 모델을 만든다. 결과의 임상 번역을 개선하기 위해, 우리는 최근에 ACL 손상의 새로운 비 침습적 모델을 개발했습니다, 여기서 ACL은 정골 압축의 단일 부하를 통해 파열된다. 이 부상은 밀접하게 인간과 관련된 부상 조건을 복제하고 매우 재현할 수 있습니다.

로드 장치는 두 개의 사용자 지정 빌드 된 로딩 플랫폼 (그림 1)으로 구성됩니다. 상단 무릎 단계는 단단히 선형 액추에이터 (DC 선형 액추에이터 L16-63-12-P, 피젯, 앨버타, CA)에 장착되어 30 °1-3 도시 플렉션의 오른쪽 뒷다리를 위치하고 100 °1 무릎 굴곡의 상대적 페비에 대한 공간을 제공하면서. 바닥 단계는 구부러진 무릎을 잡고 로드 셀 (HDM Inc., PW6D, 사우스 필드, MI) 바로 위에 장착됩니다. 부상 동안, 쥐는 마취되고 오른쪽 뒷다리는 8mm /s의 속도로 단 하나 의 정골 압축을 받게됩니다.1 ACL 부상은 사용자 정의 프로그램을 통해 모니터링되는 부상 중 압축력의 방출에 의해 지적된다 (LabVIEW, 내적 인스트루먼트, 오스틴, 텍사스). 부상 후, ACL 파열은 대기력이 경골에 적용되는 동안 대퇴골이 고정되는 Lachman의 시험에 의해 임상적으로 확인됩니다. 과도한 전방 선통 번역은 ACL 결핍을 나타냅니다. 그런 다음 ACL 부상 힌드림을 확장하여 사용자 정의 3D 인쇄 장치에서 고정하여 무릎 관절 변성을 시각화할 수 있습니다. 이미지는 PTOA 개발과 관련된 궤적 구조의 변화를 특성화하기 위해 획득됩니다. 4

Figure 1
그림 1: 격리된 비침습적 ACL 손상을 일으키는 티비알 압축 부하.

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Procedure

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비침습적 ACL 부상

  1. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 호흡 마스크를 사용할 수 있지만 이 프로토콜에는 필수가 아닙니다.
  2. 5% 이소플루란과 1 L/min 산소를 가진 유도 챔버를 사용하여 쥐를 마취시화합니다. 1 - 3 % 이소플루란과 산소의 500 mL / 분코 콘을 통해 사용하여 마취의 흐름을 유지합니다. 장치가 백드래프트 또는 다운드래프트 테이블에 설치되지 않은 경우 탁상 시스템과 숯 필터를 사용하여 폐가스를 청소해야 합니다.
  3. 발가락 핀치를 수행하여 충분한 심도의 마취에 도달했는지 확인합니다. 프로토콜이 신속하게 수행되고 (3 분 <) 눈 윤활제를 적용 할 필요가 없으며 각막 건조의 위험이 최소화됩니다.
  4. 대퇴골에 비해 경골의 전방 잠복을위한 공간을 제공하면서 도시 플렉션의 30 ° 및 무릎 굴곡의 100 ° 오른쪽 뒷다리를 배치합니다.
  5. 상단 무릎 스테이지를 선형 액추에이터에 단단히 장착합니다.
  6. 구부러진 무릎을 로드 셀 바로 위에 장착하는 하단 스테이지에 배치합니다.
  7. 8mm/s의 속도로 단일 적재량의 티비알 압축을 사용하여 ACL 부상을 유도합니다.
  8. ACL 부상은 압축력의 방출에 의해 지적된다. 이 모니터링은 사용자 지정 프로그램을 통해 모니터링됩니다.
  9. 부상 후, 동물은 마취의 비행기 아래에 있는 동안, 임상적으로 ACL 파열이 발생했는지 확인하기 위하여 Lachman의 시험을 능력을 발휘합니다. Lachman의 시험은 sagittal 계획 안정성을 평가하여 ACL의 무결성을 평가하는 데 사용되는 임상 테스트입니다. 대퇴골을 안정시키는 동안, 경골을 앞으로 당기고(전방 방향으로) 운동량을 평가합니다. 그대로 ACL은 연구원이 경골을 앞으로 번역 할 수없는 '확고한 최종 느낌'을 생성합니다. 부상당한 ACL은 찢어진 ACL을 나타내는 '부드럽거나 무성한 최종 느낌'을 생성합니다.
  10. 대퇴골과 경골을 만지며 뼈 손상을 감지합니다. 금기 사항이 확인되지 않으면 동물을 케이지로 옮기고 복구할 수 있습니다. 이 시간 동안, 그것은 통증의 흔적을 표시 하지 않습니다 확인 하려면 동물을 모니터링, 이동 을 꺼려 등, 발성, 또는 비정상적인 자세.

관절 변성의 μCT 이미징

2-D 이미지는 70kV, 현재 85.5 μA(그림2B)의스캐너 설정을 사용하여 얻을 수 있습니다. 데이터는 완전한 180°를 통해 11.5 μm의 해상도로 0.6° 회전 단계마다 수집됩니다. 단면 이미지는 매끄러운 백 프로젝션 알고리즘과 재구성된 이미지의스택(그림 2C)을사용하여 재구성됩니다. 그 후, 1.53mm 구체가 내측 및 측면 티비알 고원 및 대퇴골의 에피피실 플레이트를 중심으로 하여 궤적 두께(μm), 궤적 분리(μm) 및 궤적 번호(1/mm)를 결정한다. 5,6

  1. 에서 4 주 후 ACL 부상, 유도 챔버에서CO2에 장기간 노출쥐를 안락사.
  2. 사용자 지정 3D 인쇄장치(그림 2A)에서ACL 부상 뒷다리를 확장하고 보호합니다.
  3. μCT를 사용하여 이미지를 획득합니다.
  4. 공동 공간을 결정하기 위해 전두엽 비행기 방사선 촬영을 가져옵니다. 수축 (대퇴 동변과 경골 고원 사이 [mm로 측정]) 비 부상 사지에 비해.
  5. 70kV 및 현재 85.5 μA : 다음 스캐너 설정을 사용하여 2-D 이미지를 가져옵니다.
  6. 전체 180°를 통해 11.5 μm의 픽셀 크기로 0.6° 회전 단계마다 데이터를 수집합니다.
  7. 재구성된 이미지 스택에서 매끄러운 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 단면 이미지를 재구성합니다.
  8. 일관된 관심 영역을 측정하기 위해 내측 및 측면 티브리얼 고원 및 대퇴골의 에피피실 플레이트에 1.53mm 구를 배치하여 궤적 두께(μm), 궤적 분리(μm), 및 궤적 번호(1/mm)를 결정합니다.

Figure 2
그림 2: A) μCT, B) 2D 이미지 및 C) 3-D μCT 동안 뒷다리를 고정하는 사용자 정의 인쇄 장치.

가장 일반적인 무릎 부상 중 하나는 전방 십자 인대의 파열 또는 눈물입니다, 또한 ACL이라고, ACL 부상의 거의 1/3은 외상 후 골관절염의 결과로, 또는 PTOA, 10 년 이내에.

쥐 모델은 쥐 무릎 관절이 인간의 무릎 관절에 가까운 모델이기 때문에, PTOA에 ACL 부상의 효과를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. ACL 상해의 가장 널리 이용되는 모형은 합동이 외과적으로 불안정한 ACL 편선입니다. 그러나 이 모델은 인간에서 ACL 부상 조건을 정확하게 복제하지 않습니다.

이 비디오에서는 새로운 비침습적 쥐 ACL 부상 모델을 논의하고, 부상과 부상당한 관절의 이미징을 시연하고, 인대 수리에 대한 생물 의학 공학 분야의 연구를 마지막으로 검토할 것입니다.

무릎은 세 개의 뼈, 대퇴골, 슬개골 및 경골로 구성됩니다. 전방 십자 인대, 또는 ACL은 경골의 전방 간 관두 공간에서 상승하고 대퇴골의 측면 응집체의 후면 측면에 우수하고 측면으로 확장 조밀 한 결합 조직의 밴드 같은 구조입니다.

무릎의 다른 인대에는 후방 십자 인대, 측면 측부 인대 및 내측 측부 인대가 포함됩니다. 구조적으로, 모든 인대, 특히 ACL은 동적 운동 중에 관절을 제어하는 데 도움이되는 허벅지 근육과 함께 무릎의 수동 안정제 역할을합니다.

ACL에 가장 큰 스트레스는 무릎이 연장 에 가까운 때 발생, 그리고 ACL부상의 가장 높은 위험에이 시간 동안. 동물 모델은 관절 부상과 치료를 연구하는 실용적이고 임상적으로 관련된 방법을 모두 제공합니다. 특히 쥐 무릎 모델은 쥐 무릎이 인간의 무릎과 매우 유사하기 때문에 무릎 부상을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 인간에서 임상적으로 관련된 ACL 부상을 모델링하기 위해 단일 적중하가 적용됩니다. 올바르게 수행하면 ACL이 완전히 파열됩니다.

그런 다음 ACL 부상된 뒷다리는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 또는 Micro CT를 사용하여 관절 부상과 변성을 시각화할 수 있습니다. 마이크로 CT는 엑스레이를 사용하여 관절과 같은 물체의 이미지를 만드는 이미징 기술입니다. 이러한 단면은 개체 를 가로질러 측정되고 결합되어 3차원 재구성을 만듭니다. 마이크로 CT에 대한 자세한 내용은 이 컬렉션의 비디오를 시청하십시오.

이제 우리는 새로운 논의했습니다, 비 침습적 쥐 ACL 부상 모델, 부상이 어떻게 수행되는지 살펴 보자, 관절의 마이크로 CT 시각화 다음에.

ACL 부상은 마취 된 쥐의 경골에 단일 압축 부하를 유도하는 사용자 정의 장치를 사용하여 수행됩니다. 첫째, 5%의 이소플루란과 분당 1리터의 산소로 인덕션 챔버에 쥐를 놓습니다. 일단 마취되면, 1 ~ 3 %의 이소플루란의 흐름을 유지하기 위해 코 콘을 사용하여 장치에 쥐를 이동합니다. 오른쪽 뒷다리를 도자플렉시닝 30도, 무릎 굴곡 100도에 놓습니다.

선형 액추에이터에 장착된 상단 무릎 스테이지를 초당 1밀리미터로 이동합니다. 대퇴골에 비해 경골의 전방 잠복을위한 공간을 제공해야합니다. 그런 다음, 하부 셀 위에 장착된 하단 스테이지에 구부러진 무릎을 배치합니다. 쥐가 제대로 배치되면 사용자 지정 장치를 켜고 랩 뷰를 열고 초당 8밀리미터의 압축 속도를 입력합니다. 이어서, 단일 하중의 정골 압축을 이용하여 ACL 파열을 유도하기 위한 테스트를 실행한다. 테스트를 실행할 때 절차를 모니터링합니다. ACL 부상은 압축력의 방출에 의해 지적된다.

부상 후 장치에서 쥐를 제거하고 평평한 표면에 놓습니다. 그런 다음 Lachman의 테스트를 수행하여 ACL의 무결성을 평가합니다. 대퇴골을 안정시키는 동안 경골을 앞으로 당깁니다. 그대로 ACL은 단단한 엔드포인트를 생성하는 반면, 부상당한 ACL은 부드러운 엔드 느낌을 생성합니다. Lachman의 시험이 수행되면, 마취에서 깨어 날 수 있도록 그 하우징에 쥐를 반환합니다.

이제 손상된 조인트이미지를 이미지화해 보겠습니다. 마이크로 CT 이미징을 준비하기 위해 AVMA 지침에 따라 쥐를 인도적인 방식으로 안락사시하십시오. 그런 다음 여러 플라스틱 지퍼 타이를 사용하여 ACL 부상 뒷다리를 확장하고 고정하고 신중하게 사용자 정의 장치로 기동합니다. 뒷다리는 원물 관 내에서 완전히 확장되어야 합니다.

마이크로 CT 단계와 호환되는 적절한 용기에 쥐 체의 나머지 부분을 고정합니다. 그런 다음 마이크로 CT 기기에 고정 된 조인드를 배치하고 85.5 마이크로 앙스트롬의 전류와 180도에 대한 11.5 미크론의 해상도에서 70 킬로볼트의 스캐너 설정을 사용하여 관절에 뼈의 2 차원 이미지를 습득한다. 0.6도 회전시 5초의 노출 시간을 사용합니다. 전체 180도를 통해 0.6도 회전, 2 차원 이미지를 수집합니다. 그런 다음 알고리즘을 사용하여 이미지를 재구성하여 조인트의 3차원 이미지를 만듭니다. 궤적 뼈 특성을 확인하려면 먼저 소프트웨어 플러그인을 사용하여 관절의 볼륨 렌더링을 획득합니다.

그런 다음 직교 투영을 보고 슬라이스를 통해 이동하여 내측 및 측면 티브고원의 에피피실 플레이트와 대퇴골의 내측 및 측면 응집 사이의 원하는 위치를 선택합니다. 다음으로, 원하는 위치에서 무릎을 자르고 1.53 밀리미터 구로 마스크하십시오. 대화형 임계값을 사용하여 골격에 레이블을 지정하고 이미지를 비나이즈합니다. 지금, 골관절염의 개시의 측정인 궤상 뼈 두께를 계산합니다.

다른 위치에 대해 반복하고 다른 궤적 뼈 특성을 정량화합니다. 이미징 후, 당신은 육안 검사와 무릎을 열어 ACL 파열을 확인할 수 있습니다. 이렇게 하려면 먼저 피부를 제거합니다. 캡슐에 혈액이 있고 ACL 부상의 특징이라는 것을 의미하는 hemarthrosis를 보아야 합니다.

지금, 전방 단두엽 대퇴골, 슬개골 및 ACL을 드러내기 위하여 합동을 계속 엽니다. 로크만의 검사를 수행하여 관절을 더욱 열고 관절의 혈액과 ACL의 고립된 근접 눈물을 관찰한다.

이제, 급성 ACL 부상과 쥐 무릎 ACL 후 4 주 부상과 쥐 무릎에 관절 변성과 반경 뼈 구조를 비교 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 급성 ACL 부상으로 쥐 무릎의 재구성 된 3-D 이미지를 보고 4 주 후 ACL 부상. 반구 체진 두께, 숫자 및 간격은 에피피실 플레이트의 중심에 있는 4개의 다른 위치에서 계산되고 비교됩니다.

더 작은 반경 수, 감소된 반구 두께 및 더 큰 반경 간격은, 급성 ACL 상해를 가진 쥐 무릎에 비해 비침습적인 ACL 눈물 후에 4 주 분명했습니다. 이 모든 것은 외상 후 골관절염의 발병의 특징적인 특성입니다.

다양한 동물 모델은 ACL 부상의 연구뿐만 아니라 새로운 치료를 평가하는 데 중요합니다. ACL 부상에 대 한 현재 치료 중 하나는 조직 이식을 사용 하 여 인대 재건. 이 연구에서, 연구원은 폴리 카펠락톤을 사용 하 여 섬유 조직 이식을 만들었습니다. 세포 이식편은 그 때 쥐로 이식되고, 자연적인 인대를 대체했습니다.

이식편은 대퇴골과 경골 고원에 구멍을 뚫고 구멍을 통과하고 봉합사로 고정하여 무릎 관절에 고정되었다. 16 주 후에, 조직학 분석은 발판 매트릭스가 섬유아세포에 의해 침투되고 고분자가 그것의 거의 기록으로 대체로 resorbed되었다는 것을 보여줍니다. 엔지니어링 인대는 또한 체외에서 공부할 수 있습니다.

이 연구에서, 인간 세포는 ACL 잔재에서 분리 하 고 문화에서 확장. 세포는 다음 엔지니어링 인대 구조를 형성하기 위해 앵커와 코팅 된 접시에 배양되었다. 피브린 형성을 장려하기 위해 피브리노겐을 추가 한 후, 플레이트는 인큐베이터에서 배양되었다.

28 일 후, 피브린은 두 앵커 사이에 선형 조직을 형성했다. 연구의이 유형은 연구원 성장 인자와 호르몬의 다른 유형의 역할을 이해 하는 수 있습니다., ACL 대체 조직을 합성, 생체 에서 ACL 수리를 장려 하는 방법을 결정.

당신은 ACL 부상을 유도하고 시각화하기 위해 쥐 모델의 사용에 대한 Jove의 소개를 보았다. 쥐 모델이 인대 부상과 이 연구 분야의 여러 응용 분야를 연구하고 이미지화하는 데 어떻게 사용되는지 이해해야 합니다.

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Results

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더 작은 반경 수, 감소된 반구 두께 및 더 큰 반구 간격, PTOA 발병의 모든 특징특성은 비침습적 ACL눈물(표 1도 3)후에4주 후에 분명하게 드러났습니다. 급성 다친 사지 대 건강한 사지의 해부 된 ACL의 이미지가 도 5에도시된다. ACL이 단일 하중을 통해 파열되는 ACL 부상의 새로운 비침습적 모델은 ACL의 고립된 근접 눈물을 생성할 수 있었습니다.

Figure 4
그림 3: 급성 ACL 부상(왼쪽)의 3-D 재구성 μCT 영상(왼쪽)과 4주 후 ACL 부상(오른쪽)이 쥐에서 분리된다.

표 1: PTOA 발병의 특성 측정.

동물 Tb.N
(1/mm)
Tb.Th
m)
TB.Sp
m)
급성 ACL 부상 3.11 168.5 217
ACL 이후 4ws 부상 2.63 166.7 213

Figure 5
그림 4: 급성 부상 ACL 사지의 이미지 (왼쪽)와 손상되지 않은, 건강한 ACL (오른쪽)의 이미지.

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Applications and Summary

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이 비디오는 선형 액추에이터를 사용하여 쥐에서 격리된 비침습적 ACL 파열을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 부상은 밀접하게 인간과 관련된 부상 조건을 복제하고 매우 재현할 수 있습니다. 기존의 OA 염색 기술의 몇 가지 주요 한계를 극복하기 위해 이 방법은 μCT를 사용하여 전체 관절 변성과 궤적 구조를 정량화합니다.

근골격계 재활 결과를 개선하기 위한 증거 기반 개입은 기초 생물학의 중요한 진보가 재활 프로토콜에 대한 변경이 오래 지났다는 것을 제안했음에도 불구하고 지난 2년 동안 거의 변하지 않은 매우 중요한 영역입니다. 문제는 고전적인 재활 전문가가 진료소로 번역하기 전에 모형 유기체에서 시험되는 정보에 입각한 가설을 제공하기 위하여 기본적인 과학 보다는 오히려 임상 사례를 형성하기 위하여 일화 보고서를 이용했다는 것입니다. 여기에 설명된 절차는 과학자에게 인간과 관련된 외상성 관절 상해를 밀접하게 복제하고 관절 건강의 진행을 추적하기 위해 μCT를 사용하는 방법을 제공합니다.

재료 목록:

설비 회사 카탈로그 번호 코멘트
선형 액추에이터 피젯 L16-63-12-P
로드 셀 HDM 주식회사 PW6D
μ 코네티컷 자이스 XRM Xradia 520

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References

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