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Visualização da degeneração articular do joelho após lesão não invasiva da LCA em ratos
 
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Visualização da degeneração articular do joelho após lesão não invasiva da LCA em ratos

Overview

Fonte: Lindsey K. Lepley1,2, Steven M. Davi1, Timothy A. Butterfield3,4 e Sina Shahbazmohamadi5,

1 Departamento de Cinesiologia, Universidade de Connecticut, Storrs, CT; 2 Departamento de Cirurgia Ortopédica, Centro de Saúde da Universidade de Connecticut, Farmington, TC; 3 Departamento de Ciências da Reabilitação, Universidade de Kentucky, Lexington, KY; 4 Centro de Biologia Muscular, Departamento de Fisiologia, Universidade de Kentucky, Lexington, KY; 5 Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Connecticut, Storrs, CT

A lesão do ligamento cruzado anterior (LCA) no joelho aumenta drasticamente o risco de osteoartrite pós-traumática (PTOA), pois aproximadamente um terço dos indivíduos demonstrará PTOA radiográfica na primeira década após a lesão da LCA. Embora a reconstrução da ACL (ACLR) restaure com sucesso a estabilidade das articulações do joelho, o ACLR e as técnicas atuais de reabilitação não impedem o aparecimento de PTOA. Portanto, a lesão da LCA representa o modelo ideal para estudar o desenvolvimento do ATOA após lesão articular traumática.

Modelos de ratos têm sido usados extensivamente para estudar o início e o efeito da lesão da LCA no PTOA. O modelo mais utilizado da lesão da LCA é a transeção ACL, que é um modelo agudo que desestabiliza cirurgicamente a articulação. Embora prático, este modelo não imita fielmente a lesão da ACL humana devido aos procedimentos invasivos e não fisiológicos de lesão que mascaram a resposta biológica nativa à lesão. Para melhorar a tradução clínica de nossos resultados, desenvolvemos recentemente um novo modelo não invasivo de lesão de LCA onde a LCA é rompida através de uma única carga de compressão tibial. Esta lesão replica de perto as condições de lesão relevantes para os seres humanos e é altamente reprodutível.

A visualização da degeneração articular através da tomografia microcomputada (μCT) proporciona vários avanços importantes sobre as técnicas tradicionais de coloração de OA, incluindo imagens 3D rápidas, de alta resolução e não destrutivas de toda a degeneração articular. O objetivo desta demonstração é introduzir a lesão de ACL não invasiva de última geração em um modelo de roedor e usar μCT para quantificar a degeneração das articulações do joelho.

Principles

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A ACL é uma estrutura semelhante a uma banda de tecido contivo denso que surge do espaço intercondílar anterior da tíbia e se estende superior e lateralmente ao aspecto posterior do condíle lateral do fêmur. Estruturalmente, a LCA serve tanto como estabilizador passivo do joelho, trabalhando em conjunto com outros ligamentos, bem como musculatura da coxa para ajudar a controlar a articulação durante o movimento dinâmico. A LCA é a principal contenção ao deslocamento tibial anterior e desempenha um papel essencial na manutenção da estabilidade das articulações do joelho. Além do suporte estrutural, a LCA também atua como um caminho para informações neurais entre a articulação do joelho e o sistema nervoso central. O maior estresse na LCA ocorre quando o joelho está próximo da extensão, e é durante esse tempo que a LCA está com maior risco de lesão.

A LCA é o ligamento do joelho mais comumente ferido durante atividades relacionadas ao esporte e ao trabalho. As lesões de LCA não-contato representam quase 70% de todas as lesões da LCA, e ocorrem quando uma pessoa gera forças e/ou momentos suficientes no joelho que leva ao carregamento excessivo da LCA. Embora o mecanismo de lesão da LCA não-contato tenha sido investigado utilizando uma variedade de modelos de pesquisa (prospectivos, retrospectivos, observacionais, in vivo e in vitro),uma determinação direta de como a lesão ocorre permanece evasiva. A reconstrução da LCA é frequentemente realizada inserindo cirurgicamente uma porção dos indivíduos tendão ou tendão patelar na área da LCA. O objetivo da reconstrução cirúrgica é maximizar a estabilidade do joelho e a capacidade funcional que foram perdidas após a lesão. A reconstrução cirúrgica facilita um retorno seguro ao esporte e promove a saúde das articulações do joelho a longo prazo. No entanto, apesar dos melhores esforços de médicos e pesquisadores, quase dois terços dos pacientes com ACL reconstruídos não voltam à atividade aos 12 meses após a reconstrução e mais de 50% dos joelhos reconstruídos da ACL têm sinais radiográficos de 5-14 anos após a lesão.

Os modelos animais fornecem uma forma prática e clinicamente relevante de estudar a história natural e a resposta do tratamento à saúde articular. É importante ressaltar que o joelho de um rato tem anatomia semelhante e função aos joelhos em humanos, o que torna o joelho do rato um modelo útil para estudar PTOA após lesão da LCA. Para melhorar a tradução clínica de nossos resultados, desenvolvemos recentemente um novo modelo não invasivo de lesão da LCA, onde a LCA é rompida através de uma única carga de compressão tibial. Esta lesão replica de perto as condições de lesão relevantes para os seres humanos e é altamente reprodutível.

O dispositivo de carga consiste em duas plataformas de carregamento personalizadas (Figura 1); o estágio superior do joelho é rigidamente montado a um atuador linear (atuador linear DC L16-63-12-P, Phidgets, Alberta, CA) que posiciona o nível traseiro direito em 30°1-3 de dorsiflexão e 100° 1 deflexão do joelho enquanto fornece espaço para subluxação anterior da tíbia em relação ao fêmur; o estágio inferior contém o joelho flexionado e é montado diretamente acima de uma célula de carga (HDM Inc., PW6D, Southfield, MI). Durante a lesão, os ratos são anestesiados e, em seguida, o retrolimb direito é submetido a uma única carga de compressão tibial a uma velocidade de 8 mm/s.1 Lesão de LCA é notada por uma liberação de força compressiva durante a lesão que é monitorada através de um programa personalizado (LabVIEW, National Instruments, Austin, TX). Após a lesão, a ruptura da LCA é clinicamente confirmada pelo teste de Lachman, onde o fêmur é fixado enquanto uma força anterior é aplicada na tíbia. A tradução tibial anterior excessiva indica deficiência de LCA. O hindlimb lesionado da ACL pode então ser estendido e protegido em um dispositivo impresso 3D personalizado para visualizar a degeneração da articulação do joelho. As imagens são adquiridas para caracterizar mudanças na estrutura trabecular relacionadas ao desenvolvimento do PTOA. 4

Figure 1
Figura 1: Carga compressiva tibial causando lesão isolada não invasiva da LCA.

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Procedure

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Lesão ACL não invasiva

  1. Use equipamentos de proteção pessoal adequados. Você pode usar uma máscara respiratória, mas não é obrigatório para este protocolo.
  2. Anestesiar os ratos usando uma câmara de indução com 5% de isoflurano e 1 L/min de oxigênio. Mantenha o fluxo de anestesia usando através de um cone de nariz com 1 - 3% isoflurane e 500 mL/min de oxigênio. Se o aparelho não estiver configurado em uma tabela de recuo ou de rascunho, certifique-se de que o gás residuado seja retirado usando um sistema de mesa e filtros de carvão.
  3. Realize uma beliscão dos dedos dos dedos para garantir que uma profundidade adequada de anestésico tenha sido atingida. Note que não é necessário aplicar lubrificante ocular o protocolo é realizado rapidamente (< 3 min) e há risco mínimo de secura da córnea.
  4. Posicione o recuo direito em 30° de dorsiflexão e 100° de flexão do joelho, proporcionando espaço para subluxação anterior da tíbia em relação ao fêmur.
  5. Montar rigidamente o estágio superior do joelho para um atuador linear.
  6. Posicione o joelho flexionado no estágio inferior, que é montado diretamente acima de uma célula de carga.
  7. Induzir lesão de LCA usando uma única carga de compressão tibial a uma velocidade de 8 mm/s.
  8. A lesão da LCA é notada por uma liberação de força compressiva. Isso é monitorado através de um programa personalizado.
  9. Após a lesão, enquanto o animal ainda está sob o plano de anestesia, faça um teste de Lachman para confirmar clinicamente que ocorreu uma ruptura da LCA. Um teste de Lachman é um teste clínico usado para avaliar a integridade da LCA avaliando a estabilidade do plano sagital. Ao estabilizar o fêmur, puxe a tíbia para a frente (em uma direção anterior) para avaliar a quantidade de movimento. Uma ACL intacta produzirá uma "sensação final firme" onde o pesquisador não será capaz de traduzir a tíbia para a frente. Uma ACL lesionada produzirá uma "sensação final macia ou mole", indicativo de uma LCA rasgada.
  10. Palpar o fêmur e a tíbia para detectar qualquer dano ósseo grosseiro. Se não forem identificadas contraindicações, transfira o animal para sua gaiola e permita que ele se recupere. Durante esse tempo, monitore o animal para garantir que ele não exiba sinais de dor, como relutância em se mover, vocalização ou postura anormal.

μCT imagem de degeneração articular

As imagens 2D são obtidas utilizando-se configurações de scanner de 70 kV, corrente de 85,5 μA(Figura 2B). Os dados são coletados a cada etapa de rotação de 0,6° em uma resolução de 11,5 μm através de um total de 180°. As imagens transversais são reconstruídas usando um algoritmo de projeção traseira suavizada e na pilha de imagens reconstruídas(Figura 2C). A estrutura trabecular é então analisada por segmentação em software, pelo qual uma esfera de 1,53 mm está centrada na placa epífise dos platôs tibiais medial e lateral e fêmur para determinar a espessura trabecular (μm), separação trabecular (μm) e número trabecular (1/mm). 5,6

  1. Com 4 semanas de lesão pós-ACL, eutanize o rato com exposição prolongada ao CO2 na câmara de indução.
  2. Estender e proteger a cetro lesionado da ACL em um dispositivo impresso em 3D personalizado(Figura 2A).
  3. Adquira imagens usando μCT.
  4. Obtenha radiografias do plano frontal para determinar o espaço articular. estreitamento (entre o condíle femoral e o planalto tibial [medido em mm]) em comparação com o membro não ferido.
  5. Obtenha imagens 2D usando as seguintes configurações do scanner: 70 kV e corrente de 85,5 μA.
  6. Colete os dados a cada passo de rotação de 0,6° em um tamanho de pixel de 11,5 μm através de um total de 180°.
  7. Reconstrua imagens transversais usando um algoritmo de projeção traseira suavizada na pilha de imagens reconstruídas.
  8. Para garantir que uma região de interesse consistente seja medida, coloque uma esfera de 1,53 mm na placa epífise dos platôs tibiais medial e lateral e fêmur para determinar a espessura trabecular (μm), separação trabecular (μm) e número trabecular (1/mm).

Figure 2
Figura 2: A) Dispositivo impresso personalizado para segurar o cetão traseiro durante as imagens μCT, B) 2D e C) 3-D μCT.

Uma das lesões mais comuns no joelho é a ruptura ou ruptura do ligamento cruzado anterior, também chamado de LCA, com quase um terço das lesões da LCA resultando em osteoartrite pós-traumática, ou PTOA, dentro de uma década.

Modelos de ratos têm sido amplamente utilizados para estudar o efeito da lesão da LCA no PTOA, já que a articulação do joelho do rato é um modelo próximo da articulação humana do joelho. O modelo mais utilizado de lesão da LCA é a transeção da LCA, onde a articulação é cirurgicamente desestabilizada. No entanto, este modelo não replica com precisão as condições de lesão da LCA em humanos.

Neste vídeo, discutiremos um novo modelo de lesão de ACL de rato não invasivo, demonstraremos a lesão e imagens de articulação lesionada e, finalmente, revisaremos pesquisas no campo de engenharia biomédica sobre reparação de ligamentos.

O joelho é composto por três ossos, o fêmur, a patela e a tíbia. O ligamento cruzado anterior, ou ACL, é uma estrutura semelhante a uma banda de tecido contivo denso que sobe do espaço intercondílar anterior da tíbia e se estende superior e lateralmente ao aspecto posterior do condíle lateral do fêmur.

Os outros ligamentos do joelho incluem o ligamento cruzado posterior, o ligamento colateral lateral e o ligamento colateral medial. Estruturalmente, todos os ligamentos, especialmente a LCA, servem como estabilizadores passivos do joelho, juntamente com a musculatura da coxa para ajudar a controlar a articulação durante o movimento dinâmico.

O maior estresse na LCA ocorre quando o joelho está próximo da extensão, e é durante esse tempo que a LCA está com maior risco de lesão. Os modelos animais fornecem uma maneira prática e clinicamente relevante de estudar lesões articulares e tratamento. O modelo do joelho de rato, em particular, é amplamente utilizado para estudar lesões no joelho, já que o joelho do rato se assemelha muito ao joelho humano. Para modelar uma lesão de LCA clinicamente relevante em humanos, uma única carga de compressão tibial é aplicada. Quando feito corretamente, isso causa ruptura total da LCA.

Os membros traseiros feridos pela LCA podem então ser imagens usando tomografia microcomputada, ou Micro CT, para visualizar lesões articulares e degeneração. Micro CT é uma técnica de imagem que usa raios-x para criar imagens de um objeto, como uma articulação. Estas seções transversais são medidas através do objeto, e combinadas para criar uma reconstrução tridimensional. Para mais informações sobre micro CT, assista ao vídeo nesta coleção.

Agora que discutimos o novo modelo de lesão de ACL de rato não invasivo, vamos dar uma olhada em como a lesão é feita, seguida pela visualização micro CT da articulação.

A lesão da LCA será realizada usando um dispositivo personalizado, que induzirá uma única carga de compressão na tíbia de um rato anestesiado. Primeiro, coloque um rato em uma câmara de indução com 5% de isoflurane e um litro por minuto de oxigênio. Uma vez anestesiado, mova o rato para o dispositivo usando um cone de nariz para manter um fluxo de um a três por cento de isoflurane. Posicione o membro traseiro direito a 30 graus de dorsaflexão e 100 graus de flexão do joelho.

Mova o estágio superior do joelho, que é montado para um atuador linear, a um milímetro por segundo. Certifique-se de dar espaço para a subluxação anterior da tíbia, em relação ao fêmur. Em seguida, posicione o joelho flexionado no estágio inferior, que é montado direcionado acima de uma célula de carga. Uma vez que o rato esteja devidamente posicionado, ligue o dispositivo personalizado, abra a visão do laboratório e insira uma velocidade de compressão de oito milímetros por segundo. Em seguida, execute o teste para induzir a ruptura da LCA usando uma única carga de compressão tibial. Ao fazer o teste, monitore o procedimento. A lesão da LCA é notada pela liberação de força compressiva.

Após a lesão, remova o rato do dispositivo e coloque-o em uma superfície plana. Em seguida, realize o teste de Lachman para avaliar a integridade da ACL. Enquanto estabiliza o fêmur, puxe a tíbia para a frente. Uma ACL intacta produz um ponto final firme, enquanto uma ACL lesionada produz uma sensação de extremidade suave. Uma vez que o teste de Lachman tenha sido realizado, devolva o rato à sua carcaça para permitir que ele acorde da anestesia.

Agora vamos imaginar a articulação danificada. Para se preparar para a micro tomografia, eutanize o rato de forma humana de acordo com as diretrizes da AVMA. Em seguida, estenda e proteja os membros traseiros feridos pela ACL usando vários laços de plástico e, cuidadosamente, manobrá-los no dispositivo personalizado. O membro traseiro deve ser totalmente estendido dentro do tubo cônico.

Fixar o resto do corpo do rato em um recipiente apropriado compatível com o estágio micro CT. Em seguida, coloque a articulação segura no instrumento micro CT e adquira imagens bidimensionais dos ossos na articulação usando configurações de scanner de 70 quilovolts a uma corrente de 85,5 microangstroms e resolução de 11,5 mícrons para 180 graus. Use um tempo de exposição de cinco segundos em rotação de 0,6 graus. Colete imagens bidimensionais, girando a cada 0,6 graus ao longo dos 180 graus. Em seguida, reconstrua as imagens usando um algoritmo para criar uma imagem tridimensional da articulação. Para determinar as características ósseas trabeculares, primeiro use um plugin de software para adquirir uma renderização de volume da articulação.

Em seguida, veja projeções ortogonais e mova-se através de fatias para selecionar o local desejado entre a placa epífise dos platôs tibiais medial e lateral, e os condyles medial e lateral do fêmur. Em seguida, corte o joelho no local desejado e mascara-o com uma esfera de 1,53 milímetros. Use limiares interativos para rotular o osso e binarizar a imagem. Agora, calcule a espessura do osso trabecular, que é uma medida do início da osteoartrite.

Repita para diferentes locais e quantifique outras características ósseas trabeculares. Após a imagem, você pode querer confirmar a ruptura da LCA por inspeção visual e abrindo o joelho. Para fazer isso, primeiro remova a pele. Você deve ver uma hemartiose, o que significa que há sangue na cápsula e é característico de uma lesão de LCA.

Agora, continue abrindo a articulação para expor o fêmur distal anterior, a patela e a LCA. Realize um teste de Lochman para abrir ainda mais a articulação e observar o sangue na articulação e na ruptura proximal isolada da LCA.

Agora, vamos comparar a degeneração articular e a estrutura óssea trabecular em um joelho de rato com uma lesão aguda de LCA e um joelho de rato quatro semanas após lesão na LCA. Aqui, vemos imagens 3D reconstruídas de um joelho de rato com uma lesão aguda da LCA e em quatro semanas após lesão na LCA. A espessura do osso trabecular, o número e o espaçamento são calculados em quatro locais diferentes no centro da placa epífise e comparados.

Um número trabecular menor, espessura trabecular reduzida e maior espaçamento trabecular, ficou evidente quatro semanas após a ruptura não invasiva da LCA, em comparação com o joelho do rato com uma lesão aguda da LCA. Todas essas são características marcantes do início da osteoartrite pós-traumática.

Vários modelos animais são importantes não só para o estudo das lesões da LCA, mas também para avaliar novos tratamentos. Um dos tratamentos atuais para lesão da LCA é a reconstrução do ligamento usando um enxerto tecidual. Neste estudo, os pesquisadores criaram um enxerto de tecido fibroso usando policaprolactona. O enxerto acelular foi então implantado em ratos, substituindo o ligamento natural.

O enxerto foi fixado na articulação do joelho perfurando furos no fêmur e planalto tibial, passando o enxerto pelos orifícios e protegendo com suturas. Após 16 semanas, a análise histológica demonstra que a matriz do andaime tornou-se infiltrada por fibroblastos e que o polímero foi em grande parte resorgado com pouca evidência de que permaneceu. Os ligamentos projetados também podem ser estudados in vitro.

Neste estudo, as células humanas foram isoladas dos remanescentes da LCA e expandidas na cultura. As células foram então cultivadas em placas revestidas com âncoras para formar construções de ligamentos projetadas. Após a adição de fibrinogênio para incentivar a formação de fibrinas, as placas foram cultivadas em uma incubadora.

Após 28 dias, a fibrina formou tecido linear entre as duas âncoras. Esse tipo de estudo permite que os pesquisadores entendam o papel de diferentes tipos de fatores e hormônios de crescimento, que sintetizem o tecido de substituição da LCA e determinem maneiras de incentivar a reparação da LCA in vivo.

Você acabou de assistir a introdução de Jove ao uso de um modelo de rato para induzir e visualizar lesões da LCA. Agora você deve entender como o modelo de rato é usado para estudar e lesão ligamentar de imagem e várias aplicações deste campo de estudo.

Obrigado por assistir!

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Results

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Número trabecular menor, espessura trabecular reduzida e maior espaçamento trabecular, todas as características marcantes do início do PTOA, foram evidentes 4 semanas após o rasgo de LCA não invasivo(Tabela 1 e Figura 3). Uma imagem de uma LCA dissecada de membro saudável versus um membro ferido agudo é mostrada na Figura 5. O novo modelo não invasivo da lesão da LCA, onde a LCA é rompida através de uma única carga de compressão tibial, foi capaz de produzir uma ruptura proximal isolada da ACL.

Figure 4
Figura 3: Imagem μCT reconstruída em 3D de uma lesão aguda de LCA (esquerda) e 4 semanas após lesão de LCA (direita) em um rato.

Tabela 1: Medições características do início do PTOA.

Animal Tb.N
(1/mm)
Tb.Th
m)
TB.Sp
m)
ACL aguda ferida 3.11 168.5 217
4 wks lesão pós-ACL 2.63 166.7 213

Figure 5
Figura 4: Imagem de um membro ACL ferido agudo (esquerda) e imagem de LCA intacta e saudável (direita).

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Applications and Summary

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Este vídeo demonstra como um atuador linear pode ser usado para produzir uma ruptura isolada não invasiva da LCA em ratos. Esta lesão replica de perto as condições de lesão relevantes para os seres humanos e é altamente reprodutível. Para superar várias das principais limitações das técnicas tradicionais de coloração OA, este método utiliza μCT para quantificar toda a degeneração articular e estrutura trabecular.

Intervenções baseadas em evidências para melhorar os resultados de reabilitação musculoesqueléticos são uma área altamente significativa que pouco mudou nas últimas duas décadas, embora avanços significativos na biologia básica tenham sugerido que as alterações nos protocolos de reabilitação estão muito atrasadas. A questão é que especialistas em reabilitação clássica têm usado relatórios anedóticos para moldar a prática clínica em vez de ciência básica para fornecer hipóteses informadas que são testadas em organismos modelo antes da tradução para a clínica. Os procedimentos descritos aqui fornecem aos cientistas um método para replicar de perto uma lesão articular traumática que é relevante para os seres humanos e usar μCT para acompanhar a progressão da saúde articular.

Lista de materiais:

Equipamento Companhia Número do catálogo Comentários
Atuador linear Phidgets L16-63-12-P
Célula de carga HDM Inc. PW6D
μ CT Zeiss XRM Xradia 520

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References

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  2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
  3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
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  5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
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Transcript

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