높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 분자 및 세포 생물학과에서 온 Bruce Draper입니다. 그리고 저는 시애틀에 있는 Fred Hutchinson 암 연구 센터 기초 과학 부문의 Cecilia Moans입니다. 오늘 저와 Cecilia는 Brian Harvey의 원본 프로토콜을 수정한 제브라피쉬 정자 동결 보존 프로토콜을 시연하고자 합니다. 저희는 두 명씩 팀을 이루어 작업하면 2시간 이내에 100마리의 개별 수컷 정자를 동결 보존하는 것이 가능하다는 점을 보여드릴 것입니다.

해동 후 가임력의 범위는 매우 다양하지만, 평균적으로 25%의 가임력을 얻고 있으며, 이는 7년 이상 냉동 보존된 라이브러리 결과입니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차를 수행하기 전, 먼저 정자 동결 용액을 제조하십시오.

Ginsburg Fish ringer 용액은 3일마다 새로 조제하며, 동결 매질은 메탄올 포함 여부에 따라 매일 새로 조제합니다. 이 용액들의 조성은 본 프로토콜에 수반되는 온라인 보충 정보에서 확인할 수 있습니다. 이 절차에 사용되는 재료들은 동결 및 해동 속도에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 결과적으로 동결 정자의 수태능력에 영향을 줄 수 있습니다.

이러한 이유로 권장 재료 목록이 온라인 보충 정보로 함께 제공됩니다. 정자는 드라이아이스 펠렛보다는 곱게 부순 드라이아이스 위에서 냉동하는 것이 가장 좋습니다. 드라이아이스를 부수는 간단한 방법 중 하나는 수건으로 감싼 뒤 망치로 가루 내는 것입니다.

더욱 효율적인 방법은 claws and model RE two와 같은 드라이아이스 그라인더를 사용하여 제브라피쉬 정자를 동결하는 것입니다. 먼저 실험실용 펜을 사용하여 10 µL 모세관 튜브의 3.33 µL 지점 또는 바닥에서 약 16.7 mm 높이에 표시합니다. 수컷을 마취시키기 위해 trica가 희석된 어류용수에 수컷 2~4마리를 비커에 넣습니다. 해당 처방은 제브라피쉬 도서에서 확인할 수 있습니다.

마취가 완료되면 플라스틱 스푼을 사용하여 물고기를 마취액에서 건져내고 페이퍼 타월 위에서 부드럽게 닦아 물기를 제거합니다. 특히 복부 쪽을 닦는 데 주의를 기울이십시오. 물은 정자를 활성화시키므로 유두(ika) 주변을 철저히 건조시키는 것이 매우 중요합니다.

물고기의 배 쪽이 위로 향하도록 스폰지 홀더 위에 놓습니다. 배지느러미 주변 부위가 여전히 젖어 있다면, Kim wipe로 부드럽게 닦아 건조시킵니다. 표시된 모세관을 모세관과 함께 제공된 고무 마우스 피펫 어댑터에 끼웁니다.

어댑터는 한쪽 끝에 마우스피스가 있고 다른 쪽 끝에 모세관 홀더가 있는 고무 호스입니다. 또는 모세관을 50 µL Hamilton 시린지에 연결할 수도 있습니다. 적절한 직경의 짧은 Tigon 튜브를 사용하여 수컷을 현미경 아래에 두고, 골반지느러미를 조심스럽게 벌려 비뇨생식공을 노출시킵니다.

모세관의 끝부분을 사용하여, 매끄러운 핀셋으로 물고기의 측면을 부드럽게 쓸어내리거나 검지와 엄지로 물고기의 측면을 살짝 눌러 정자를 배출시킵니다. 정자가 배출될 때 부드럽게 흡입하여 모세관에 수집하십시오. 정자와 함께 배출될 수 있는 분변이 섞이지 않도록 주의하십시오. 정자의 목표 수집량은 3.3 µL입니다.

허용 가능한 최소 정자 양은 정자의 품질에 따라 다릅니다. 상태가 좋은 정자는 흰색이며 불투명한 반면, 품질이 낮은 정자는 묽게 보입니다. 일반적으로 허용 가능한 최소 정자 양은 양질의 정자인 경우 1 µL 또는 목표량의 1/3이며, 품질이 낮은 정자인 경우 2 µL 또는 목표량의 2/3입니다.

정자 부피가 목표 부피인 3.3 µL에 도달하지 않은 경우, 메탄올이 포함되지 않은 동결 매질을 사용하여 펜 표시선까지 부피를 정규화해야 합니다. 정자의 부피가 이미 모세관의 펜 표시선에 도달했거나 초과한 경우에는 다음 단계로 진행하십시오. 이제 정자에 동결보존제를 첨가합니다.

메탄올이 포함된 동결 매질을 주황색 표시선까지 흡입합니다. 이때의 대략적인 총 부피는 20 µL입니다. 정자와 동결보호제 혼합물을 시계 유리(watch glass)의 깨끗한 영역에 분출한 후, 피펫팅을 약 4회 반복하여 부드럽게 혼합하며 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다.

라벨이 부착된 각 크라이오 바이알 바닥에 정자 동결보존액 10 µL를 피펫팅하여 정자를 두 개의 크라이오 바이알로 분주합니다. 신속하게 바이알의 캡을 닫고, 각 크라이오 바이알을 각각 별도의 15 mL 팰컨 튜브에 넣습니다. 실온에서 팰컨 튜브의 캡을 닫고 고운 가루 형태의 드라이아이스에 삽입합니다.

falcon tube를 식별할 수 있도록 캡 부분만 보이게 튜브를 충분히 깊게 삽입해야 합니다. 각 튜브에 번호를 매기고 드라이아이스에 넣은 시간을 기록하십시오. 정자가 드라이아이스에서 20분 동안 동결되도록 둡니다.

정자를 동결한 후, 두 개의 cryo vial을 액체 질소가 들어 있는 듀어 플라스크(dewar flask)로 옮깁니다. 일시적인 보관을 위해, 샘플이 가열되지 않도록 냉동 보관 박스를 액체 질소 배스(bath)에 넣으십시오.

긴 금속 집게를 사용하여 듀어 플라스크에서 바이알을 꺼내고, 극저온 장갑을 착용하여 취급하십시오. 또는, 크라이오 바이알을 드라이아이스에서 냉동고로 직접 옮길 수도 있습니다. 장기 보관을 위해 스티로폼 용기에 담긴 액체 질소에 냉동고 박스를 계속 침전시켜 두는 경우, 크라이오 바이알을 극저온 액체 질소 냉동고에 보관하십시오.

정자의 생존력을 유지하기 위해서는 바이알을 액체 질소에 침지하여 보관하는 것이 매우 중요하며, 기상(vapor phase)에 보관된 바이알은 시간이 지남에 따라 생존력이 저하될 수 있습니다. 또한 정자 생존력 유지에는 속도가 매우 중요합니다. 동결보호제를 첨가한 후 정자 바이알을 드라이아이스 위에 놓기까지의 시간은 30초 이내여야 합니다. 체외 수정.

냉동 보존된 정자를 사용할 때는 두 사람이 함께 작업하는 것이 가장 효율적입니다. 한 사람은 암컷으로부터 난자를 짜내고, 다른 한 사람은 정자를 해동합니다. 항온수조를 33 °C로 설정하십시오.

액체 질소 냉동고에서 크라이오 바이알을 꺼내 해동 준비가 될 때까지 액체 질소가 담긴 듀어(Dewar) 또는 플라스크로 옮깁니다. 마취된 암컷 제브라피시로부터 알을 짜내어 35 millimeter 플라스틱 페트리 접시에 담습니다. 이 과정은 제브라피시에 대해 자세히 설명하고 있는 Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure라는 제목의 JoVE 프로토콜에 상세히 기술되어 있습니다.

체외 수정 시, 양질의 난자 뭉치(clutch)는 균일하고 황색을 띠는 난자가 150개 이상 포함되어 있어야 합니다. 흰색 부유물이 보인다면 이는 퇴화되었음을 나타냅니다. 가능하다면 세 뭉치의 난자를 확보하여 하나의 배양 접시에 합치십시오.

첫 번째 클러치 이후 1분 이내에 양호한 클러치 3개를 얻지 못한 경우, 다음 단계로 진행하십시오. 정자가 해동되는 동안 디쉬의 덮개를 닫아 두십시오. 그동안 바이알을 액체 질소에서 꺼내 캡을 제거합니다.

바이알을 33°C 항온수조에 8~10초 동안 빠르게 절반만 담급니다. 실온의 Hank's buffered salt solution 70 µL를 바이알에 빠르게 가하고 피펫팅으로 혼합한 후, 즉시 페트리 접시에 담긴 난자에 첨가하고 피펫 팁으로 부드럽게 섞어줍니다. 그런 다음 어항수 750 µL를 가하여 정자와 난자를 즉시 활성화하고, 소용돌이 모양으로 섞어 실온에서 5분 동안 배양합니다.

5분 후, 디쉬에 물고기와 물을 채우고 28°C에서 배양합니다. 2~3시간 후, 생존 가능한 배아의 수를 세어 100mm 디쉬로 디쉬당 50개씩 옮깁니다. 또한 정자 샘플의 수정 능력을 결정할 수 있도록 수정란의 수도 세어 줍니다.

정자 수정능은 체외 수정을 위해 사용된 전체 난자 수 대비 생존 배아의 비율입니다. 난자는 체외 수정 후 2시간에서 6시간 사이 언제든지 분류할 수 있습니다. 수정되지 않은 난자는 투명하고 분할되지 않은 상태이므로 생존 배아와 쉽게 구별할 수 있습니다.

실체 현미경의 투과 조명으로 관찰했을 때, 냉동 보존된 정자의 평균 수정률은 매우 다양하게 나타납니다. 하지만 수년 동안 안정적으로 평균 25%의 수정률을 유지하는 것이 가능해야 합니다. 이 그래프는 2001년에서 2003년 사이에 냉동되었다가 최근 2008년까지 사용된 정자의 평균 수정률 백분율을 보여줍니다.

본 영상에서는 제브라피쉬 정자의 고효율 동결 보존 방법을 시연하였습니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 권장되는 모든 플라스틱 소모품과 장비를 사용하는 것이 중요하며, 드라이아이스 펠릿보다는 분쇄된 가루 형태의 드라이아이스를 사용해야 합니다. 매우 우수한 품질의 정자와 난자를 사용하는 것이 필수적이며, 특히 체외 수정을 위해 정자를 해동하여 난자에 처리할 때, 최종적으로 얻게 될 수정란의 수를 늘리기 위해 가능한 한 많은 수의 난자를 사용하는 것이 중요합니다. 이를 위해 3~4마리의 암컷이 필요할 수 있습니다.

프로토콜의 또 다른 핵심 요소는 속도입니다. 수컷으로부터 정자를 추출하여 드라이아이스에 넣기까지 약 1분 이상 걸려서는 안 됩니다. 이것으로 모두 마친 것 같습니다.

실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.