Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 제브라피시의 다섬모 세포를 in situ에서 라벨링하고 시각화하는 것입니다. 이 방법은 배아 제브라피시 신장에서 다섬모 황산염을 조절하는 인자는 무엇인가와 같은 발달 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질과 RNA 전사체를 동시에 라벨링할 수 있다는 점이며, 이는 제브라피시 전용 항체가 없을 때 유용합니다.

우리는 배아에 변화를 준 후 섬모의 존재 여부를 분석하던 중, 전신(pronephros)의 다섬모 세포를 표지하려는 아이디어에서 처음 이 방법을 고안했습니다. 우선, 수정 후 24시간 된 제브라피시 배아를 4% paraformaldehyde 5mL에 넣고 실온에서 흔들림 없이 2~4시간 동안 고정합니다. 그 다음, 0.1% Tween 20이 포함된 PBS 또는 PBST로 배아를 2회 세척한 후, 100% methanol 5mL로 1회 세척합니다.

그 후, 배아를 5 mL의 신선한 100% ethanol에 넣고 -20 °C에서 최소 20분 동안 배양합니다. 하이브리다이제이션을 위해 배아를 준비하려면, 신생 배아를 5 mL의 50% methanol 및 PBST에서 5분 동안 재수화시킨 후, 5 mL의 30% methanol 및 PBST에서 5분 동안 처리합니다. 배아를 5 mL의 PBST로 각각 5분씩 두 번 세척하고, 1:1,000으로 희석한 proteinase K 및 PBST 용액 5 mL에서 2분 동안 배양한 직후, 5 mL의 PBST로 두 번 더 세척합니다.

배아를 4% 파라포름알데히드 5mL에 넣고 상온에서 최소 20분 동안 고정시킨 후, PBST 20 5mL로 두 번 세척합니다. 배아와 하이브리드화 용액 간의 상호작용을 용이하게 하기 위해, 배아를 마이크로 원심분리기 랙에 꽂힌 바닥이 평평한 수직 마이크로 원심분리 튜브 내의 PBST 5mL로 옮기고, 하이브리드화 용액 1.5mL로 5분씩 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 배아를 신선한 하이브리드화 용액 1.5mL에 넣고 하이브리드화 오븐을 이용하여 70°C에서 4~6시간 동안 배양합니다.

그런 다음, 하이브리다이제이션 용액을 관심 RNA 프로브 10 µL와 하이브리다이제이션 용액 500 µL로 교체하고 70 °C에서 하룻밤 동안 프로브 하이브리다이제이션을 수행합니다. 다음 날 아침, 70 °C에서 50% formamide와 2X saline-sodium citrate buffer 또는 SSC 1.5 mL로 배아를 2회 세척하며, 회당 세척 시간은 20~30분입니다. 이어서 70 °C에서 2X SSC 1.5 mL로 배아를 1회 15분 동안 세척한 후, 70 °C에서 0.2X SSC 1.5 mL로 2회 세척하며 회당 세척 시간은 20~30분입니다.

두 번째 세척 후, 0.2X SSC를 1.5 milliliters의 블로킹 시약으로 교체하고 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다. 다음 날 아침, 블로킹 시약을 1:1,000 비율로 희석한 horseradish peroxidase 결합 anti-digoxin 및 블로킹 시약 0.2 milliliters로 교체하고, 빛을 차단한 상태에서 상온으로 3시간 동안 인큐베이션합니다. 그런 다음, 1.5 milliliters의 말산 완충액으로 배아를 2~4회 세척하며, 회당 10~15분씩 세척합니다. 이어서 1.5 milliliters의 신선한 말산 완충액에서 4°C로 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.

다음 날 아침, 말산 완충액을 1.5 milliliters의 PBS로 교체하고, 1.5 milliliters의 PBS에서 배아를 2회 세척하며 각 세척당 5분 동안 진행합니다. 배아를 0.2 milliliters의 Si3 형광 정지 용액에서 60분 동안 배양한 후, 농도가 증가하는 메탄올 1.5 milliliters 용액에서 10분씩 4회 연속으로 세척합니다. 마지막 배양 후, 배아를 실온에서 1% hydrogen peroxide와 메탄올 혼합액 1.5 milliliters에 넣고 30분 동안 배양합니다.

그런 다음, 1.5 milliliters의 내림차순 메탄올 용액으로 회당 10분씩 배아를 세척하고, 이어서 1.5 milliliters의 PBS로 5분씩 두 번 세척합니다. 다음으로, 1.5 milliliters의 2회 증류수로 배아를 5분간 세척한 후, -20 °C 아세톤 1.5 milliliters로 7분간 세척합니다. 다시 1.5 milliliters의 2회 증류수로 배아를 5분간 세척하고, 이어서 1% DMSO가 포함된 PBST 또는 PBDT 1.5 milliliters로 5분간 세척합니다.

배아를 10% FBS가 포함된 PBDT 1.5 milliliters 내에서 실온의 로커(rocker) 위에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, PBDT와 FBS를 1차 항체 1.5 milliliters로 교체하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 배아를 PBDT, FBS 및 0.1 molar 염화나트륨 1.5 milliliters에서 1분간 로킹하며 세척한 뒤, PBDT, FBS 및 염화나트륨 1.5 milliliters에서 30분간 로킹하는 세척 과정을 5회 반복합니다.

마지막 세척 후, 배아를 1.5 milliliters의 PBDT 및 FBS에서 30분 동안 로킹(rocking)하며 1회 세척한 다음, 빛이 차단된 4 degrees Celsius에서 적절한 2차 항체 200 microliters에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 배아를 1.5 milliliters의 PBDT로 빠르게 2회 세척하고, 이어서 로커 위에서 1.5 milliliters의 DAPI에 15분 동안 배양합니다. 그런 다음, FBS와 염화나트륨이 포함된 1.5 milliliters의 PBDT로 배아를 3회 세척하며, 회당 15~20분 동안 세척합니다. 마지막으로 배아를 주변 빛이 차단된 4 degrees Celsius의 1.5 milliliters PBDT에 보관합니다.

제브라피시 신장을 이미징하려면, 배아를 약 10 µL의 PBDT가 담긴 유리 슬라이드 위에 측면으로 눕힙니다. 미세 핀셋과 해부 현미경을 사용하여, 첫 번째 배아의 눈 뒤쪽을 눌러 머리와 난황의 일부를 제거합니다. 그런 다음, 배아 몸체에서 남은 난황을 조심스럽게 긁어냅니다.

난황구를 제거할 때, 관심 조직이 쉽게 찢어지고 확장부 바로 위에 위치해 있으므로 난황낭 확장부를 건드리지 않도록 주의하십시오. 얇은 티슈를 사용하여 슬라이드에서 분리된 난황과 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음, 남은 꼬리에 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨리고 꼬리를 가로 방향으로 배치합니다.

커버슬립으로 꼬리를 평평하게 누른 다음 슬라이드를 커버 슬라이드 박스에 넣습니다. 그 후, 공초점 현미경의 60X 대물렌즈를 사용하여 적절한 형광 채널에서 신장의 섬모를 이미징합니다. 방금 설명한 방식으로 염색된 제브라피쉬 배아의 다음 대표 이미지에서, ODF3B 전사체 발현을 인식하는 안티센스 리보프로브, 감마-튜불린으로 표지된 기저체 및 아세틸화 알파-튜불린으로 표지된 섬모의 시각화를 통해 다섬모 세포를 식별할 수 있습니다.

실제로, 배아 전신(pronephros)의 이 배율에서는 ODF3B 전사체, 다수의 기저체 및 섬모를 가진 다섬모 세포를 관찰할 수 있습니다. 인접한 단섬모 세포는 단일 기저체와 단일 섬모 표현형을 통해 구별할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 신선하게 고정된 배아를 사용하고, 1차 항체를 첨가한 후에는 시료가 주변 빛에 노출되지 않도록 보호하는 것이 중요합니다.