Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 제브라피시의 다섬모 세포를 현장에서 라벨링하고 시각화하는 것입니다. 이 방법은 배아 제브라피시 신장에서 다중섬모 황산염을 조절하는 요인이 무엇인지와 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질과 RNA 전사체를 동시에 라벨링할 수 있다는 것인데, 이는 제브라피시 특이적 항체가 없을 때 유용합니다.

이 방법에 대한 아이디어는 배아에 변화를 준 후 섬모의 존재를 분석하는 동안 프로네프로스에서 다섬모 세포를 라벨링하려고 했을 때 처음 떠올랐습니다. 수정 후 24시간이 지나면 제브라피시 배아를 4% 파라포름알데히드 5ml에 넣고 교반 없이 실온에서 2-4시간 동안 고정하는 것으로 시작합니다. 다음으로, PBS에서 0.1% Tween 20 또는 PBST로 배아를 두 번 세척한 다음 100% 메탄올 5ml로 한 번 세척합니다.

그런 다음 섭씨 영하 20도에서 최소 20분 동안 신선한 100% 에탄올 5ml에 배아를 배양합니다. 배아가 혼성화될 수 있도록 50% 메탄올과 PBST를 5ml 농도로 5분 동안 재수화한 다음 50% 메탄올 및 PBST 5mL를 5분 동안 재수화합니다. 5ml의 PBST로 배아를 각각 5분씩 2회 세척하고 5ml의 1:1, 000 proteinase K 및 PBST 용액에 배아를 2분 동안 배양한 다음 5ml의 PBST로 2회 더 세척합니다.

5ml의 4%파라포름알데히드에 배아를 실온에서 최소 20분 동안 고정한 다음 5ml의 PBST 20을 2회 세척합니다. 배아와 혼성화 용액 간의 상호작용을 촉진하기 위해, 배아를 마이크로 원심분리기 랙의 직립형 평면 바닥 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 5ml의 PBST로 옮기고 1.5ml의 혼성화 용액에서 배아를 각각 5분씩 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 섭씨 70도의 신선한 혼성화 용액 1.5ml에 배아를 혼성화 오븐에서 4-6시간 동안 배양을 배양합니다.

그런 다음 혼성화 용액을 10마이크로리터의 관심 RNA 프로브와 500마이크로리터의 혼성화 용액으로 교체하여 섭씨 70도에서 하룻밤 동안 프로브 혼성화를 수행합니다. 다음날 아침, 1.5ml의 50% 포름아미드와 2X 식염수-구연산나트륨 완충액 또는 SSC로 배아를 섭씨 70도에서 세척할 때마다 20-30분 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 1.5ml의 2X SSC로 70°C에서 15분 동안 배아를 한 번 세척한 다음 70°C에서 1.5mL의 0.2X SSC로 세척당 20-30분 동안 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후 0.2X SSC를 1.5mL의 차단 시약으로 교체하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날 아침, 차단 시약을 양고추냉이 과산화효소에 0.2ml의 안티 디곡신으로 교체하고 1:1, 000 비율의 차단 시약으로 교체하여 빛으로부터 보호된 실온에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 1.5ml의 말산 완충액으로 배아를 1회당 10-15분 동안 2-4회 세척한 다음 1.5ml의 신선한 말산 완충액을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음날 아침, 말산 완충액을 1.5ml의 PBS로 교체하고 1.5ml의 PBS로 배아를 세척할 때마다 5분씩 두 번 세척합니다. 0.2 밀리리터의 Si3 형광 스탠딩 용액에서 배아를 60분 동안 배양한 후 1.5 밀리리터의 상승 메탄올 농도에서 4회 연속 10분 세척합니다. 마지막 배양 후 배아를 실온에서 1.5ml의 1% 과산화수소와 메탄올로 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 1.5ml 하강 메탄올 용액으로 세척당 10분 동안 배아를 세척한 다음 1.5mL의 PBS에서 5분씩 두 번 세척합니다. 다음으로, 1.5ml의 이중 증류수로 배아를 5분 동안 씻은 다음 1.5ml의 섭씨 영하 20도의 아세톤으로 7분 동안 씻습니다. 배아를 1.5ml의 이중 증류수로 5분 동안 세척한 다음 1.5ml의 PBST에 1% DMSO 또는 PBDT가 함유된 5분 동안 세척합니다.

배아를 1.5ml의 PBDT와 10% FBS가 포함된 실온에서 로커에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBDT 및 FBS를 1.5ml의 1차 항체로 교체하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다. 다음날 아침, 1.5ml의 PBDT, FBS 및 0.1몰 염화나트륨으로 배아를 흔들어 1분 동안 세척한 다음 1.5ml의 PBDT, FBS 및 염화나트륨으로 30분 동안 5회 흔들어 세척합니다.

마지막 세척 후, 배아를 1.5ml의 PBDT와 FBS에 한 번 한 번 흔들어 30분 동안만 세척한 다음 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 적절한 2차 항체 200마이크로리터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, 1.5ml의 PBDT로 배아를 두 번 빠르게 세척한 다음 1.5ml의 DAPI를 로커에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 FBS와 염화나트륨이 든 1.5ml의 PBDT로 배아를 15-20분 동안 3회 세척하고 배아를 섭씨 4도의 PBDT 1.5ml에 넣어 주변광으로부터 보호합니다.

제브라피쉬 신장을 이미지화하려면 약 10마이크로리터의 PBDT에 배아를 유리 슬라이드에 측면으로 놓습니다. 한 쌍의 미세한 집게와 해부 현미경을 사용하여 눈 뒤의 첫 번째 배아를 짜서 머리와 난황 뭉치 일부를 제거합니다. 그런 다음 배아의 몸에 남아 있는 난황 덩어리를 부드럽게 긁어냅니다.

노른자 볼을 제거하는 동안 관심 조직이 쉽게 찢어지고 확장 바로 위에 있으므로 난황낭 확장을 만지지 않도록 주의하십시오. 얇은 티슈를 사용하여 슬라이드에서 해리된 노른자와 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 나머지 꼬리에 장착 매체 한 방울을 추가하고 꼬리를 측면으로 배치합니다.

커버 슬립으로 꼬리를 평평하게 하고 슬라이드를 덮개가 있는 슬라이드 상자에 넣습니다. 그런 다음 컨포칼 현미경에서 60X 대물렌즈를 사용하여 적절한 형광 채널에서 신장의 섬모를 이미지화합니다. 방금 시연된 바와 같이 염색된 제브라피시 배아의 다음 대표 이미지에서, ODF3B 전사체 발현을 인식하는 데 사용되는 안티센스 리보프로브, 배우자 튜불린 표지 기저체 및 아세틸화 알파 튜불린 표지 섬모의 시각화를 기반으로 다섬모 세포를 식별할 수 있습니다.

실제로, 이러한 배아 프로네프로스의 확대에서 ODF3B 전사체를 가진 다섬모 세포, 여러 기저체 및 섬모가 관찰될 수 있습니다. 인접한 단섬모 세포는 단일 기저체(single basal body)와 단일 섬모 표현형(single cilium phenotype)으로 구별할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 새로 고정된 배아를 사용하고 첫 번째 항체가 추가된 후 표본을 주변광으로부터 보호하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.