Name: Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 제브라피시 다중섬모세포를 형광 레이블링하여 시각화하는 방법을 통해 신장 기관 형성에서 섬모의 역할을 연구하세요. 이 기술은 단백질과 RNA 전사체를 동시에 표지하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 원시와 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 제를 부여 R01DK100237에 의해 부분적으로 지원 A.N.M. DGE-1313583 우리는 또한 대학의 과학 여름 학부 연구 친교 프로그램 M.U. 지원 위한 감사 합니다. 우리는 Zebrafish의 Notre Dame 대학 우리의 zebrafish의 전용된 그들의 관리에 대 한 연구는 센터를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 생물 학적 과학의 부서 뿐만 아니라 그들의 지원 및 중요 한 통찰력의 모든 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다.

다음 프로토콜 사용 zebrafish 성인 Zebrafish의 Notre Dame 대학에서 연구를 위한 센터에 의해를 걱정 하 고 유지 합니다. Zebrafish 성인 및 태아에 대 한 모든 방법은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 배아 고정
<ol><li>Zebrafish 태아 앞에서 설명한 방법39,40을 사용 하 여 수집 합니다. 24 hpf, 배아에 E3에 일반적인 효소 혼합물 해결책 (50 mg/mL)의 500 µ L 상 온 (RT) 품 요리를 추가.</li>
	<li>배아는 chorion의 돌발을 시작, 일단 태아 요리에서 모든 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>E 3의 약 20 mL를 추가 하 고, 부드럽게 접시에는 E3 소용돌이 다음 액체 폐기물 용기에 액체를 decanting 여 2-3 회 신선한 E3와 배아를 씻어.</li>
	<li>수정 하기 전에 배아를 안락사는 e 3에 0.2 %tricaine 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 5 mL 유리 유리병에 배아를 전송 합니다. 배아는 유리병의 바닥에 정착 후는 피 펫을 사용 하 여 tricaine/E3 솔루션의 대부분을 제거 합니다.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde (PFA)의 5 mL와 함께 동요 없이 RT에 2-4 h 24 hpf 배아 수정. 주의: PFA 독성 하 고 연구원 눈 보호, 장갑, 그리고 실험실 외 투를 착용 하는 동안 화학 후드 PFA 솔루션을 처리 해야 합니다. 입자가 굵은 PFA 파우더 PFA 정착 액의 준비 입자가 굵은 PFA 정전기를 통해 분산 경향으로 우수한 치료와 함께 수행 되어야 한다. 참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다 준비 4 %PFA 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 종 x 1 지속적으로 해결책을 교 반 하면서가 열 하 여 완전히 입자가 굵은 PFA 해산. 일단 솔루션은 실시간, PFA는 0.45 μ m 진공 여과 위한 일회용 시스템을 통해 그것을 전달 하 여 살 균 필터 4% 아래로 다시 냉각 후 및 저장-20 ° c.에 대 한 15 mL 또는 50 mL 부분으로 aliquoted</li>
	<li>4 제거 %PFA 및 1 X 인산 염 버퍼와 두 번 세척 배아 0.1% 식 염 수 트윈-20 (PBST)에서 실시간 실시간 추가 5 mL 신선한 100%에서 100% 메탄올 (MeOH)의 5 mL로 한 번 태아를 씻어 MeOH 배아를 고 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 품 어. 참고: 배아는 100%에 저장할 수 있습니다 MeOH 배아 준비를 위한 준비까지-20 ° C에서.</li>
</ol>2. 태아 준비와 교 잡
<ol><li>50%의 5 mL에 한번 세척 하 여 배아를 rehydrate MeOH 1에서 30%의 5 ml에서는 배아를 세척 하 여 실시간 계속 재에서 5 분 동안 x PBST 1에서 MeOH 실시간에 5 분 동안 x PBST 1의 5 mL에 배아를 씻어 5 분 각각에 대해 두 번 x PBST 실시간</li>
	<li>1에서 1:1,000 가수분해 K의 솔루션 (pK) (10mg/mL) 5 mL에 그들을 배양 하 여 배아를 permeabilize 실시간에서 2 분 x PBST 그러나 참고: 이전 배아 수 있습니다 알을 품을 5 mg/mL 및 외피의 농도 시간 2 분 미만, 위에 명시 된 pK 농도에서 2 분 24 미만 태아에 대 한 제안 보다 더 이상 hpf.</li>
	<li>PK 솔루션 및 세척 즉시에 1 x PBST 실시간에 두번 수정 배아 4%의 5 mL의 5 mL을 제거 PFA RT 적어도 20 분 동안에. 참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다</li>
	<li>PFA 및 세척 두 번에 1의 5 mL을 제거에서 실시간 x PBST</li>
	<li>1의 5 mL에 배아를 전송 평면 바닥 microcentrifuge 튜브 x PBST microcentrifuge 선반에 각 배아와 후속 교 잡 솔루션 간의 상호 작용을 촉진 하는 RT에 똑바로 배치.</li>
	<li>신선한 Hyb + 실시간 추가 1.5 mL에서 교 잡 솔루션 (Hyb +)의 1.5 mL에 두 번 배아를 세척 하 고 4-6 h 동안 교 잡 오븐에서 70 ° C에 태아를 품 어.</li>
	<li>프로브 솔루션의 볼륨의 Hyb + 1.5 mL를 바꿉니다 (10 µ L RNA 프로브/500 µ L Hyb +)는 배아를 완벽 하 게 커버 하기에 충분. 참고: 음성 antisense RNA 프로브를 사용 하 여 이전에 설명한 방법39합성.</li>
	<li>동요 하지 않고 microcentrifuge 랙에 위치 개별 관 직으로 70 ° C에서 교 잡 오븐에서 밤새 조사를 교배.</li>
</ol>3. 뜨거운 세척 및 차단
참고: 뜨거운 세척 배아에 적절 한 솔루션을 추가 하 고 다음 70 ° c.에서 교 잡 오븐에 잠복기에 의해 수행 됩니다. 70 ° C에 세척 솔루션을 지키려고 장소 50 mL 튜브 각 솔루션의 교 잡 오븐 때 프로브 / Hyb + 혼합물 추가 됩니다.
<ol><li>프로브를 제거 합니다. 20-30 분 각 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 x 50 %formamide / 2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어. 참고: 프로브-20 ° C에서 Hyb +에 저장 되며 나중에 다시 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 배아를 한 번 씻어 15 분에 대 한 x SSC 20-30 분 각 0.2 X SSC의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어. 차단 시 약의 1.5 mL와 바꾸기 0.2 x SSC 및 4 ° c.에서 밤새 품 어 참고: 그것은 하룻밤 대신 4 h에 대 한 실시간에 차단 시 품 어 수 있습니다.</li>
</ol>4. 항 체 외피와 Maleic 산 버퍼 세척
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>1:1,000의 비율로 차단 시에 반대로 DIG-포드의 0.2 mL 차단 시 약 교체 및 3 h 호 일 또는 실시간에 다른 빛 차단 커버 아래에 품 어 참고: 또는, 항 체 수 품 어 하룻밤에 4 ° c.</li>
	<li>3 h 후 배아를 maleic 산 2-4 회 10-15 분 각 실시간 품 배아 1.5 ml 신선한 maleic 산 버퍼의 4 ° C에서 하룻밤에 대 한 버퍼의 1.5 ml에서 씻으십시오. 참고: 그것은 하룻밤 사이, maleic 산 버퍼에서 품 어 필요가 없습니다 하지만 하 고 이렇게 조사 배경 감소.</li>
</ol>5. 프로브 탐지 및 과산화 효소의 제거
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>Maleic 산 버퍼를 제거 하 고 1x PBS의 1.5 mL를 바꿉니다. 실시간에서 60 분에 대 한 솔루션을 얼룩이 지기 형광 5 분 동안 각각 0.2 mL에 실시간 품 배아에서 Cy3의 1 x PBS의 1.5 mL에 두 번 배아를 씻어 참고: 보육 시간 다른 프로브에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>RT에서 10 분에 대 한 1 X PBS에 다음 %MeOH 1.5 mL를 한번 배아를 세척: 30 %MeOH, 50% 75 %MeOH 100% MeOH MeOH.</li>
	<li>RT에서 10 분의 1 x PBS에 다음 MeOH 솔루션의 1.5 mL를 한번 배아 실시간 세척에서 30 분 동안 MeOH에 1% H2O2 의 1.5 mL와 함께 태아를 품 어: 75 %MeOH, 50 %MeOH, 및 30 %MeOH. 1 x PBS의 1.5 ml에서 RT에서 5 분 동안 두 번 배아를 씻어. 참고: 배아에에서 저장할 수 있습니다 PBS 하룻밤에 4 ° c.</li>
</ol>6입니다. 면역 형광 검사
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>DdH2O 5 분의 1.5 ml 배아 실시간 세척에 미리 냉장된 아세톤 (-20 ° C에서 보관 하는)의 1.5 ml 배아 한 세척 실시간에서 7 분 1.5에 한번 배아 실시간 세척에 배아 ddH2O 5 분의 1.5 mL에 한 번 세척 1 mL 실시간 5 분의 1 %DMSO (PBDT)와 x PBST</li>
	<li>2 시간에 대 한 실시간에 로커에 PBDT + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1.5 mL에 태아를 품 어.</li>
	<li>PBDT + FBS를 제거 하 고 기본 항 체, 안티 acetylated tubulin (마우스에서 생산) 및 안티-γ-tubulin (토끼에서 생산), 함께 1:400 PBDT + 1%에 희석의 1.5 mL를 바꿉니다 FBS. 밤새 4 ° c.에 태아를 품 어 참고: 보육 시간 1 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 시간 간격의 테스트 라벨 최적화를 해야 수 있습니다.</li>
</ol>7. 이차 항 체
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>FBS + 로커에 RT에 1 분 동안 0.1 M NaCl 배아에서 초과 언바운드 항 체를 제거 하려면 PBDT + 1%의 1.5 ml에서 씻으십시오.</li>
	<li>배아를 씻어 PBDT + 1%의 1.5 mL에 5 번 FBS + 실시간에 로커에 각 30 분 0.1 M NaCl 배아에에서 씻어 1.5 mL PBDT + 1 %FBS 로커에 RT에서 30 분.</li>
	<li>이차 항 체의 200 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 태아를 품 어 알 렉 사 488 염소 반대로 마우스 IgG와 알 렉 사 647 염소-토끼 IgG, 1: 500에 PBDT에 함께 희석.</li>
</ol>8. DAPI 얼룩
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>워시 배아 신속 하 게 RT에서 PBDT의 1.5 mL에 두 번. PBDT DAPI의 1.5 mL, 희석 1:15000 1 X PBST에 고는 로커에 RT에서 15 분을 품 어.</li>
	<li>1.5 ml PDBT + 1%의 배아를 씻어 FBS + 0.1 M NaCl 3 번 15-20 분에 대 한 실시간에. 마운트 및 이미지 준비가 될 때까지 4 ° C에서 PBDT의 1.5 mL에 배아를 저장 합니다.</li>
</ol>9. 장착 및 Zebrafish Pronephros 이미지
<ol><li>작은 볼륨, PBDT의 약 10 µ L에에서 유리 슬라이드에 누워 태아 측면.</li>
	<li>한 켤레 미세 집게는 머리를 제거 하 고 노 른 자 공의 일부와 눈 뒤에 배아를 짠 다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 긁어 떨어진 태아 몸에서 남은 노 른 자 공. 얇은 티슈로 슬라이드에서 천연된 노 른 자 및 여분 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>미디어는 태아의 나머지 꼬리를 장착 한 방울을 추가 하 고 위치는 꼬리 옆으로 누워. 샘플, 병합 다음 커버 슬라이드 상자에 꼬리 위에 coverslip을 놓습니다.</li>
	<li>신장 속눈썹에 다음과 같은 채널을 사용 하 여 confocal 현미경 60 배 확대에 이미지: 파란색에서 DAPI (408.0 설정 레이저 nm), 녹색에서 FITC (488.0 설정 레이저 nm), Cy3 염료-표시 된 빨간색에서 (561.0 설정 레이저 nm), 및 흰색에서 알 렉 사 680 (637.0 설정 레이저 nm).</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

위의 상세한 프로토콜 pronephros odf3b 성적표와 α-tubulin 24 hpf zebrafish 태아에 있는 MCCs를 라벨에 대 한 최적화 됩니다. 최상의 결과 얻으려면 갓 고정 하 고 준비 된 배아를 사용 하는 것이 좋습니다. 고정 되어 MeOH 또는 Hyb + 1 주 이상-20 ° C에서 저장 된 배아 배아 저장소에 유지 됩니다 시간 증가 얼룩 원치 않는 배경의 확률만 사용할 수 있습니다.
수정 및이 기술의 문제 해결 특정 마커, 예를 들어 다른 센스 riboprobes 및 다른 항 체의 다른 제품군에 대 한이 메서드를 조정할 필요가 있습니다. 전체 산 현장에서 교 잡 과정 단계 매개 변수를 조정 하기 위한 많은 방법이 있다 이전 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해31,,3436,38, 문서화 39. 마찬가지로, 각 단백질 항 체 얼룩이 번, 측면에서 몇 가지 문제 해결 필요 합니다 하 고 희석 및 보육 시간 각 1 차 항 체에 대 한 대략적인 범위는 최고의 문서화 된 결과28, 의 평가 의해 추정 35. 24 미만 태아에 대 한 hpf, pK 치료 2 분 보다 짧은 있어야 어디 24 보다 오래 된 배아 hpf pK 2 분 이상 대우 되어야 한다. 또한, 24 보다 더 오래 된 배아 hpf pK 치료 하기 전에 안료의 표백 한다.
형광 성 얼룩 솔루션 얼룩 후 메탄올과 과산화 수소 세척의 시리즈를 수행 하 여 모든 나머지 얼룩, 항 체, 및 peroxidases를 제거 하는 중요 한 이다. 바로 다음 PBS 세척은 배아에서 초과 메탄올을 제거 하는 중요 한. 만약 항 체를 계속 하기 전에 중요 한 것은, 우리는 그 아세톤 및 이온된 수 세척 배아 서로 또는 원심 분리기 튜브 준수 하 게 발견 했다. 우리의 경험, 특정 전사 인자와 다른 유전자에 대 한 항 체에 그들은에서 효율적으로 일할 수 있습니다 비록 서양 지우고에서 zebrafish에 경우에 잘 작동 하지 않습니다. 그러나, 매우 보존 하 고 풍부한 단백질, tubulin α 및 β-catenin 같은 경우16,37제 브라에서 잘 작동지 않습니다.
물고기, 그것 되지 않은 아직 특정 항 체는 제 브라에서 유전자의 RNA 사본을 시각화 가능 하다. 경우 물고기를 결합해 서,이 프로토콜에 의해 증명으로 볼 vivo에서 (그림 2) RNA 사본 및 단백질의 공동 지역화 될 수 있습니다. 프로토콜의 유연한 특성 다양 한 RNA 사본 및 수많은 조직 및 시간 포인트에서 단백질의 시각화에 대 한 빠른 문제 해결 수 있습니다. Zebrafish 태아의 이미 존경 받는 특성 결합, 생선 + IF이이 프로토콜 유전자와 단백질 중요 한의 식을 발달 통로 규제를 탐험 다른 도구를 제공 합니다.

지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 개발 생물학을 공부 하는 주요 모델 생물으로 떠오르고 있다. 태아는 어머니 이상으로 개발 하 고 광학 투명. 또한, 눈, 신장, 개 등 중요 한 장기의 형성, 그냥 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된 구조와 발생 합니다. 중요 한 것은, zebrafish 게놈이 포유류1,2,3높은 보존 된다. 또한, 제 브라와 포유류 장기 비슷한 해부학과 생리학 있다. 제 브라 미 발달 신장, 또는 pronephros, 초기 nephrogenesis 및 척추 nephron4, 의 보존된 상피 세포 인구의 운명 결정 하는 동안 유전자 기능을 조사 하기 위한 모델 시스템의 값을 보여 줍니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 마찬가지로, zebrafish 태아 MCCs11,12,13,,1415, 의 그렇습니다 검사에 점점 더 중요 해지고 있다 16 , 17.
그들의 이름에서 알 수 있듯이, Mcc는 상피 세포 꼭대기 표면17에 있는 운동 속눈썹의 특징 이다. Zebrafish에서 MCCs 유체 흐름에서 작동 하 고 24 hpf11,12,,1314, "salt-and-pepper"는 pronephros의 각 nephron의 중간에 걸쳐 패션에 분산 되어 있는 15 , 16 , 17. 비록 그들은 단지 한 줌에 지적 되었습니다 인간 신장의 질병 케이스18,,1920,21, MCCs 두뇌 같은 다른 포유류 조직에서 유행 하 고 기관22,23,24, 실험 설계에 대 한 도전의 호스트 포즈는. Zebrafish를 포함 한 다양 한 척추 동물 모델에서 우아한 연구 노치 신호 전달 경로 고객 센터 개발12,,1725 의 억제제로 보존된 통로 MCC 운명의 증명 ,2627. 따라서, zebrafish pronephros MCC 개발 vivo에서11,12,,1314, 의 유전 메커니즘을 연구 하 쉽게 접근할 수 있는 모델 제공 15 , 16 , 17.
투명성과 zebrafish 태아의 쉬운 유전자 조작 입증 귀중 한 특성 세포 운명, 조직 성장, 및 초기 배아1,2 개발 유전과 분자 경로 공부를 할 때 ,3. 현장에서 교 잡 등 전체 마운트 경우 단백질 및 유전자 내용은 시각화에 적용 되었고 zebrafish16,,2829에 대 한 최적화를, 전통적인 기법으로 30,31,32,33,34,35,36,,3738. 물고기와 IF에 대 한 인기 있는 프로토콜을 결합 하 여 레이블 및 Mcc vivo에서16,28,,3738분석 하 가능 하다.

<table><tbody><tr><td>비특이적 프로테아제 혼합물 용액</td><td>Roche</td><td>11459643001, Streptomyces griseus의 프로나제를</td><td>E3 <강한>없이</강한> 메틸렌 블루로 희석하여 50mg/mL 원액 만들기;-20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>E3 용액</td><td></td><td></td> 증류<td>수에 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4)를 희석하고, 오염을 억제하기 위해 1 x 10-5 M 메틸렌 블루 (시그마 M9140)를 첨가</td></tr>하십시오.<tr><td>트리카인 (에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트)</td> <td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>0.2 % 원액을 만들려면 10 mL Tris에 트리카인 분말 1g을 용해하고, pH 9.5 및 증류수, 최대 500mL</td></tr><tr><td>배아 접시</td>, <td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5mL 유리 바이알</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드(PFA) 용액</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>19210</td><td>4X PBS에 1% PFA를 녹이고 흄 후드 아래에서 끓입니다. 식히고 부분 표본을 얻은 다음 -20°C에서 보관하십시오. 사용을 위해 한 번 해동하면 다시 냉동하지 마십시오.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>증류수에 희석하여 1X 스톡</td></tr><tr><td>Tween-20 스톡</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>증류수에 희석하여 0.1% Tween-20 스톡을 만듭니다.</td></tr><tr><td>0.1% Tween 20 (PBST)를 함유한 1X 인산염 완충 식염수</td> <td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>메탄올 (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>증류수에 용해시켜 10 mg/mL 스톡을 만듭니다. C</td></tr><tr><td>편평한 바닥 마이크로 분리기 관</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>미국 생물 분석</td><td>AB00600</td><td>-20 °C에 저장; C</td></tr><tr><td>혼성화 용액 (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% 포름아미드, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL 효모 토룰라 RNA, 50 &mu; 지/&무; L 헤파린; -20°C에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X 식염수-구연산나트륨(SSC) 완충 용액</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>증류수에 희석하여 2X 및 0.2X 스톡</td></tr><tr><td>차단 시약 용액</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>maleic acid buffer에 희석하여 10% 재고 용액을 만듭니다. 4°deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>말레 산 완충 용액</td><td>시그마</td><td>M0375 및 S7653</td><td>150mM 말레 산, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr> <tr><td>안티 디곡시게닌 -포드, 팹 단편</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>4°deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Cy3 형광 염색 용액</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 시스템</td><td>스토어 4&deg; C; 키트 버퍼에 TSA 시약(DMSO 60uL에 용해됨)을 1:50 희석하여 신선한 염색 용액을 준비</td></tr>합니다.<tr><td>과산화수소(H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td>는 <td>4°C에 보관합니다. C</td></tr><tr><td>분자 등급 증류수 (ddH2O)</td> <td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>은 -20°C에서 분취액을 저장합니다. C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>부분 표본 및 -20°C에 보관; C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acetylated tubulin 클론 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>부분 표본 및 -20°C에 보관; </td></tr><tr><td>C anti-&gamma; -tubulin anitbody는 토끼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>부분 표본에서 생산되어 -20°C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA 클론 MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>이미지:6792478</td><td>-80°C에 세균성 글리세롤 재고를 저장합니다. C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 밀가루 647 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>4&deg에 저장; C; 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>4&deg에서 저장; C; 빛으로부터 보호하십시오</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>부분 표본 및 -20°C에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18mm</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont 핀셋 패턴 #55</td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, 4&deg의 Aqua-Poly/Mount</td><td>매장; C</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 및 관련 소프트웨어</td><td></td><td></td> 우리는 NIS 요소 AR 소프트웨어 로커 Bio-Rad 1660710EDU<td>와 함께 Nikon C2plus 컨포칼 현미경을 사용합니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>.<td></td></tr></tbody></table>

multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 zebrafish에 시각화

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

최근 몇 년 동안, zebrafish 태아 배아 개발 utero 전 및 광학 투명도 같은 특성으로 인해 개발 생물학 공부를 인기 모델로 떠오르고 있다. 특히, zebrafish 태아 척추 신장 organogenesis multiciliated 셀 (MCC) 개발 공부 하는 중요 한 유기 체 되고있다. 배아 zebrafish 신장에서 MCCs를 시각화, 우리 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 결합 된 프로토콜을 개발 했습니다 하 고 전체 고해상도 이미징 수 있도록 면역 형광 (IF)를 탑재. 이 원고 공동 다양 한 혈통 요소의 표현을 통해 발달 프로그램의 규칙을 이해 하는 도구로 서 RNA 사본 및 단백질을 지역화 우리의 기술을 설명 합니다.

야생-타입 zebrafish 태아 24 고정 hpf 바로 위에서 설명한 대로 준비 하 고. 그림 1 선택한 그림된 단계 함께 실험적인 워크플로 보여 줍니다. 1-8 단계에서 설명 하는 워크플로 샘플 조달, 고정, 및 면역 형광 라벨 protein(s) 관심의 뒤 센스 riboprobes와 생 성적표를 고정된 조직의 조작의 과정을 포함 합니다. 워크플로의 단계 9 장착 및 이미징 zebrafish 배아 트렁크의 시각화를 최적화 하도록 특별히 설계 된 기술을 말합니다. 9 단계를 동반 하는 도면에서 우리 유리 슬라이드에 조직의 위치에 대 한 조작 방법을 설명 합니다. 이 단계에서 태아 머리와 노 른 자 볼 꼬리 옆으로 유리 슬라이드와 coverslip 사이 위치를 떠나 제거 됩니다. 노 른 자 공과 헤드의 제거와 노 른 자 공 자동 fluoresces 장착 과정을 방해 pronephros, 거주 고객 센터 인구 최고의 이미징에 대 한 제안입니다.
Confocal 현미경을 사용 하 여 얻은 대표 이미지 그림 2, 60 X 확대 같은 야생-타입 배아와 동일한 배율에서 디지털 줌 표시에 제공 됩니다. 상위 패널 아래쪽 두 패널은 이러한 이미지 데이터의 복합 오버레이 각 개별 채널의 이미지를 제공 합니다. (왼쪽된 열 이미지)에서 백색 상자 영역을 디지털 줌 (오른쪽 이미지)의 초점을 설명 합니다. 디지털 줌의 마지막 패널에 강조 표시, 핵, DAPI에서 표시 했다 그리고 MCCs odf3b, γ-tubulin에 항 체 나타내는 기초 시체와 α-tubulin는 속눈썹을 인식 하도록 하는 센스 riboprobe에 따라 감지 했다. 복합 오버레이의 디지털 줌에서 노란색 점선된 원 odf3b 성적표, 여러 기초, 몸과 속눈썹의 소유로 인해 확인 된 MCC의 경계를 나타냅니다. 노란 점선 동그라미 표시 된 인접 한 모노 ciliated 셀 단일 기초 신체 및 단일 cilium의 표현 형에 따라 확인 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> 그림 1: 실험 순서도의 도식. 이 중요 한 단계는 눈송이 차가운 외피를 나타냅니다의 삽화 동반 순서도 실험적인 워크플로 보여줍니다, 3 개의 곡선된 라인 열, 나타내고 시계 긴 부 화 시간을 나타냅니다. 프로토콜에서 설명한 것 처럼 오랜 시간 동안 어떤 단계를 수행할 수 있습니다 있지만 최소 6 일 (과정에서 각 단계의 숫자 오른쪽 상단 모서리에 참조)에 워크플로 수행할 수 있습니다. 설치 과정의 상세한 묘사, 유리 슬라이드와 coverslip 최종 탑재 된 배아 꼬리를 보여주는 그려집니다. 검은 점선된 박스 60 X 배율에서 이미지 영역을 설명 합니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> 그림 2: 대표 zebrafish pronephros MCCs를 시각화에 대 한 결과. 최대 이미지 확대 뿐만 아니라 같은 태아의 60 배 확대에 confocal에 디지털 줌 X 60 24 hpf 야생-타입 zebrafish 태아의 예측. 흰색 상자 확대/축소에 대 한 초점 영역을 나타냅니다. DAPI (핵), odf3b (MCCs), γ-tubulin (기초 기관), 및 α-tubulin (속눈썹)의 개별 얼룩 표시 되며 하단 2 패널에 함께 병합 다음. 디지털 줌에서 우리 같이 셀 위치의 근사를 제공: MCC 점선 노란색 원으로 개설 하 고 점선된 노란색 원 설명 모노 ciliated 셀. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 제브라피시의 다섬모 세포를 in situ에서 라벨링하고 시각화하는 것입니다. 이 방법은 배아 제브라피시 신장에서 다섬모 황산염을 조절하는 인자는 무엇인가와 같은 발달 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질과 RNA 전사체를 동시에 라벨링할 수 있다는 점이며, 이는 제브라피시 전용 항체가 없을 때 유용합니다.우리는 배아에 변화를 준 후 섬모의 존재 여부를 분석하던 중, 전신(pronephros)의 다섬모 세포를 표지하려는 아이디어에서 처음 이 방법을 고안했습니다. 우선, 수정 후 24시간 된 제브라피시 배아를 4% paraformaldehyde 5mL에 넣고 실온에서 흔들림 없이 2~4시간 동안 고정합니다. 그 다음, 0.1% Tween 20이 포함된 PBS 또는 PBST로 배아를 2회 세척한 후, 100% methanol 5mL로 1회 세척합니다.그 후, 배아를 5 mL의 신선한 100% ethanol에 넣고 -20 °C에서 최소 20분 동안 배양합니다. 하이브리다이제이션을 위해 배아를 준비하려면, 신생 배아를 5 mL의 50% methanol 및 PBST에서 5분 동안 재수화시킨 후, 5 mL의 30% methanol 및 PBST에서 5분 동안 처리합니다. 배아를 5 mL의 PBST로 각각 5분씩 두 번 세척하고, 1:1,000으로 희석한 proteinase K 및 PBST 용액 5 mL에서 2분 동안 배양한 직후, 5 mL의 PBST로 두 번 더 세척합니다.배아를 4% 파라포름알데히드 5mL에 넣고 상온에서 최소 20분 동안 고정시킨 후, PBST 20 5mL로 두 번 세척합니다. 배아와 하이브리드화 용액 간의 상호작용을 용이하게 하기 위해, 배아를 마이크로 원심분리기 랙에 꽂힌 바닥이 평평한 수직 마이크로 원심분리 튜브 내의 PBST 5mL로 옮기고, 하이브리드화 용액 1.5mL로 5분씩 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 배아를 신선한 하이브리드화 용액 1.5mL에 넣고 하이브리드화 오븐을 이용하여 70°C에서 4~6시간 동안 배양합니다.그런 다음, 하이브리다이제이션 용액을 관심 RNA 프로브 10 µL와 하이브리다이제이션 용액 500 µL로 교체하고 70 °C에서 하룻밤 동안 프로브 하이브리다이제이션을 수행합니다. 다음 날 아침, 70 °C에서 50% formamide와 2X saline-sodium citrate buffer 또는 SSC 1.5 mL로 배아를 2회 세척하며, 회당 세척 시간은 20~30분입니다. 이어서 70 °C에서 2X SSC 1.5 mL로 배아를 1회 15분 동안 세척한 후, 70 °C에서 0.2X SSC 1.5 mL로 2회 세척하며 회당 세척 시간은 20~30분입니다.두 번째 세척 후, 0.2X SSC를 1.5 milliliters의 블로킹 시약으로 교체하고 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다. 다음 날 아침, 블로킹 시약을 1:1,000 비율로 희석한 horseradish peroxidase 결합 anti-digoxin 및 블로킹 시약 0.2 milliliters로 교체하고, 빛을 차단한 상태에서 상온으로 3시간 동안 인큐베이션합니다. 그런 다음, 1.5 milliliters의 말산 완충액으로 배아를 2~4회 세척하며, 회당 10~15분씩 세척합니다. 이어서 1.5 milliliters의 신선한 말산 완충액에서 4°C로 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.다음 날 아침, 말산 완충액을 1.5 milliliters의 PBS로 교체하고, 1.5 milliliters의 PBS에서 배아를 2회 세척하며 각 세척당 5분 동안 진행합니다. 배아를 0.2 milliliters의 Si3 형광 정지 용액에서 60분 동안 배양한 후, 농도가 증가하는 메탄올 1.5 milliliters 용액에서 10분씩 4회 연속으로 세척합니다. 마지막 배양 후, 배아를 실온에서 1% hydrogen peroxide와 메탄올 혼합액 1.5 milliliters에 넣고 30분 동안 배양합니다.그런 다음, 1.5 milliliters의 내림차순 메탄올 용액으로 회당 10분씩 배아를 세척하고, 이어서 1.5 milliliters의 PBS로 5분씩 두 번 세척합니다. 다음으로, 1.5 milliliters의 2회 증류수로 배아를 5분간 세척한 후, -20 °C 아세톤 1.5 milliliters로 7분간 세척합니다. 다시 1.5 milliliters의 2회 증류수로 배아를 5분간 세척하고, 이어서 1% DMSO가 포함된 PBST 또는 PBDT 1.5 milliliters로 5분간 세척합니다.배아를 10% FBS가 포함된 PBDT 1.5 milliliters 내에서 실온의 로커(rocker) 위에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, PBDT와 FBS를 1차 항체 1.5 milliliters로 교체하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 배아를 PBDT, FBS 및 0.1 molar 염화나트륨 1.5 milliliters에서 1분간 로킹하며 세척한 뒤, PBDT, FBS 및 염화나트륨 1.5 milliliters에서 30분간 로킹하는 세척 과정을 5회 반복합니다.마지막 세척 후, 배아를 1.5 milliliters의 PBDT 및 FBS에서 30분 동안 로킹(rocking)하며 1회 세척한 다음, 빛이 차단된 4 degrees Celsius에서 적절한 2차 항체 200 microliters에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 배아를 1.5 milliliters의 PBDT로 빠르게 2회 세척하고, 이어서 로커 위에서 1.5 milliliters의 DAPI에 15분 동안 배양합니다. 그런 다음, FBS와 염화나트륨이 포함된 1.5 milliliters의 PBDT로 배아를 3회 세척하며, 회당 15~20분 동안 세척합니다. 마지막으로 배아를 주변 빛이 차단된 4 degrees Celsius의 1.5 milliliters PBDT에 보관합니다.제브라피시 신장을 이미징하려면, 배아를 약 10 µL의 PBDT가 담긴 유리 슬라이드 위에 측면으로 눕힙니다. 미세 핀셋과 해부 현미경을 사용하여, 첫 번째 배아의 눈 뒤쪽을 눌러 머리와 난황의 일부를 제거합니다. 그런 다음, 배아 몸체에서 남은 난황을 조심스럽게 긁어냅니다.난황구를 제거할 때, 관심 조직이 쉽게 찢어지고 확장부 바로 위에 위치해 있으므로 난황낭 확장부를 건드리지 않도록 주의하십시오. 얇은 티슈를 사용하여 슬라이드에서 분리된 난황과 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음, 남은 꼬리에 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨리고 꼬리를 가로 방향으로 배치합니다.커버슬립으로 꼬리를 평평하게 누른 다음 슬라이드를 커버 슬라이드 박스에 넣습니다. 그 후, 공초점 현미경의 60X 대물렌즈를 사용하여 적절한 형광 채널에서 신장의 섬모를 이미징합니다. 방금 설명한 방식으로 염색된 제브라피쉬 배아의 다음 대표 이미지에서, ODF3B 전사체 발현을 인식하는 안티센스 리보프로브, 감마-튜불린으로 표지된 기저체 및 아세틸화 알파-튜불린으로 표지된 섬모의 시각화를 통해 다섬모 세포를 식별할 수 있습니다.실제로, 배아 전신(pronephros)의 이 배율에서는 ODF3B 전사체, 다수의 기저체 및 섬모를 가진 다섬모 세포를 관찰할 수 있습니다. 인접한 단섬모 세포는 단일 기저체와 단일 섬모 표현형을 통해 구별할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 신선하게 고정된 배아를 사용하고, 1차 항체를 첨가한 후에는 시료가 주변 빛에 노출되지 않도록 보호하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

배우세요 제브라피시 다중섬모세포를 형광 레이블링하여 시각화하는 방법을 통해 신장 기관 형성에서 섬모의 역할을 연구하세요. 이 기술은 단백질과 RNA 전사체를 동시에 표지하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

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