تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحميل الكريات النانوية على الأنابيب الدقيقة ، والتي تنزلق على سطح مغطى بالكيناز في المحركات. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء سطح خلية التدفق الزجاجي أولا بمحلول الكازين. الخطوة الثانية من الإجراء هي امتصاص بروتينات كينيسين الحركية على سطح خلية التدفق.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي إضافة الأنابيب الدقيقة. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في إضافة العقدة في الجزيئات ، والتي سوف ترتبط بالأنابيب الدقيقة ، ثم إضافة الكريات النانوية. ترتبط الكريات النانوية بسطح خلية التدفق حيث قد تلتقطها الأنابيب الدقيقة.

في النهاية ، يمكن للمرء أن يلاحظ كيف يتم التقاط الكريات النانوية بواسطة الأنابيب الدقيقة ونقلها عبر السطح باستخدام الفحص المجهري الفلوري. مرحبا ، أنا إيلين جين سميث من مختبر الدكتور هنري هيس وقسم علوم وهندسة المواد بجامعة فلوريدا. سنعرض لك اليوم إجراء لمقايسة الحركة المقلوبة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تحميل البضائع على الأنابيب الدقيقة وحركة المكوكات الجزيئية. لذلك دعونا نبدأ. قبل بدء هذا الإجراء ، قم بإعداد جميع حلول المخزون حديثا كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا الفيديو.

بمجرد الانتهاء من حلول المخزون ، ابدأ في تحضير الأنابيب الدقيقة عن طريق سحب 25 ميكرولتر من محلول النمو في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 مل. ثم أضف 6.25 ميكرولتر من محلول النمو إلى 20 ميكروغراما من التوبولين المجفف بالتجميد الحيوي. قم بتدوير المحلول وضعه في حمام حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لبلمرة بعد الحضانة ، وتخفيف المحلول 100 ضعفا في Taxol Buffer ودوامة برفق.

يعمل هذا الحل على تثبيت الأنابيب الدقيقة. قم بتسمية المحلول على أنه فارغ 100 وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بعمل تخفيف عشرة أضعاف من MT 100 في المخزن المؤقت المضاد للتلاشي وقم بتسمية هذا الحل على أنه MT 1000.

ثم قم بإعداد محركات Kinesin عن طريق تخفيف محلول كينيسين 20 ضعفا في حالة وجود عازلة TP. قم بتسمية المحلول على أنه كيناز في 20 وقم بتخزينه على الثلج. أخيرا ، قم بعمل حلول الستربتافيدين والكرة النانوية.

أولا ، أضف Alexa Fluor 5 6 8 المسمى ستربتافيدين إلى تركيز 100 نانو ضرس في Antifa Buffer. قم بتسمية المحلول على أنه STV 100 ، ثم قم بتخفيف الكرات النانوية 5 ، 000 أضعاف في Antifa Buffer وقم بتسمية هذا الخليط على أنه NS 5 ، 000. قم بتخزين هذين الحلين على الثلج.

بعد تحضير الحل لمقايسة تحميل البضائع ، قم ببناء خلية تدفق باستخدام شريحة غطاء وانزلاق غطاء زجاجي مفصول بشريط على الوجهين. قم أولا بلصق شريطين من الشريط على الوجهين على حواف شريحة الغطاء ، مع ترك فجوة تبلغ حوالي سنتيمتر واحد بين الشرائط. ثم ضع زلة غطاء فوق الشريط.

اضغط على زلة الغطاء باستخدام الحافة المسطحة للملاقط لعمل ختم. يبلغ طول خلية التدفق المبنية حوالي سنتيمترين وعرضها سنتيمترا واحدا وارتفاعها 100 ميكرون ، ويبلغ حجمها حوالي 20 ميكرولترا. لبدء تجميع الفحص المقلوب.

ضع طرف الماصة بين زلة الغطاء والشريحة. ثم حقن 0.5 ملليغرام لكل مليلتر محلول الكازين في خلية التدفق. سيسمح هذا الطلاء على خلية التدفق لكينيسين بالاحتفاظ بوظائفه عند الامتصاص.

انتظر خمس دقائق حتى يتغطى محلول الكازين. بعد ذلك ، امتصاص كينيسين على خلية التدفق عن طريق إدخال الكيناز في 20 محلولا يتم إدخاله في خلايا التدفق عن طريق وضع طرف الماصة بين زلة الغطاء والانزلاق. ثم يتم حقن المحلول في خلية التدفق من جانب واحد ، بينما يتم حقنه في نفس الوقت من الجانب الآخر.

باستخدام ورق الترشيح ، اترك خمس دقائق حتى يمتص الكيناز. بعد ذلك ، أدخل الأنابيب الدقيقة في خلية التدفق عن طريق سحب محلول MT 1000 في خلية التدفق. اترك خمس دقائق حتى تستقر الأنابيب الدقيقة وتلتصق بالكيناز في المحركات بعد التعلق الأنبوبي الدقيق بالكيناز في المحركات.

قم بتغطية الأنابيب الدقيقة بالتهاب البكتيريا الفلورية TTR عن طريق إدخال محلول STV 100 في خلية التدفق. اترك خمس دقائق حتى يرتبط البكتيريا العقدية TTR في الجزيئات بالأنابيب الدقيقة. اغسل البكتيريا العقدية الزائدة TTR عن طريق إدخال ثلاث غسلات سعة 30 ميكرولتر من محلول Antifa في خلية التدفق.

أخيرا ، أدخل الكريات النانوية الفلوريسين البوليتينيل الحيوي عن طريق سحب محلول NS 5 ، 000 في خلية التدفق. يمتص السطح ثابتا. سوف تصطدم الكريات النانوية بالأنابيب الدقيقة المتحركة وتحملها عليها.

في هذه التجربة ، تم استخدام مجهر مضان Eclipse TE 2000 U مزود بهدف زيت 100 × وموقع X ، ومصباح واحد 20 وكاميرا إكسون E-M-C-C-D. أولا ، ضع قطرة واحدة من زيت الغمر على الهدف. ثم قم بتركيب خلية التدفق على مرحلة المجهر باستخدام مكعب مرشح trixy.

اجعل الأنابيب الدقيقة في بؤرة التركيز ، ثم قم بالتبديل إلى مكعب مرشح fitzy لعرض الكريات النانوية. بعد ذلك ، افتح برنامج و أو I exon واضبط وضع الاستحواذ على الحركية. استخدم وقت تعريض ضوئي يبلغ 0.5 ثانية ، وطول سلسلة حركية يبلغ 20 ووقت دورة حركية يبلغ ست ثوان.

قم بتبديل المجهر من العدسة إلى الكاميرا وابدأ في الحصول على الصور. بالنسبة للصور الأربع الأولى ، استخدم مكعب trixi لتصوير الأنابيب الدقيقة. بالنسبة للصور ال 12 التالية ، قم بالتبديل إلى مكعب مرشح فيتز للحصول على صور للكريات النانوية.

ثم عد إلى مكعب مرشح trixi. بالنسبة للصور الأربع الأخيرة لتصوير الأنابيب الدقيقة ، تتم ملاحظة الأنابيب الدقيقة باستخدام مكعب مرشح Trissy ، ويتم تبديل مكعب المرشح إلى fite لتصور الكريات النانوية هنا ، يتم تحديد الكريات النانوية التي يتم نقلها بواسطة الأنابيب الدقيقة بواسطة الأسهم. لم يتم التقاط جميع الكريات النانوية بواسطة الأنابيب الدقيقة.

الآن يظهر موقع الكريات النانوية بعد 36 ثانية ، مما يكشف أن الكريات النانوية قد تحولت. عندما يتم تصوير الأنابيب الدقيقة مرة أخرى ، يصبح من الواضح أن الأنابيب الدقيقة قد سافرت أيضا عبر مجال الرؤية. توضح هذه الصور أن الكريات النانوية قد تم إزاحتها بسبب النقل الأنبوبي الصغير.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء مقايسة الحركة المقلوبة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تبديل مكعبات المرشح أثناء الحصول على الصور بحيث يمكن رؤية كل من الأنابيب الدقيقة والكريات النانوية. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.