Name: 기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-07T16:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 성체 마우스 조직에서 CldU와 IdU를 이용한 면역형광 검출법으로 세포 분열을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 세포 회전율과 종양 형성 연구에 활용됩니다.

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JDRF, NIH (R01 - DK081469), 펜실베니아의 연방 (재생 의료 부여 4100043362에있는 우수를위한 센터), 천의 월 (바실 오코너 초보 학술 연구 수상), 그리고 펜실베니아 DERC 조종사의 대학 지원 및 타당성 부여 (DK19525).

1. CldU과 이두와 라벨링 조직 <ol><li> 물에 thymidine의 analogues을 (CldU 또는 이두) 디졸브. 각 화학 / 1mg ML을 무게와 증류수의 유리병을 별도로 추가할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 한 번에 하나씩 각 1 리터 준비합니다. </li><li> 저어 접시 또는 교반기의 다른 형태에있는 화학 물질을 디졸브. CldU 10 분 지나면 분해될 것이다. 실온에서 교반의. 이두는 37 선동의 시간 ° 통에 C 이상이 필요합니다. 워터 소스 이두의 용해도에 영향을 미칠 수있다. 이두가 밤새 떨고 후 일시 중지가 해제 남아있을 경우, 물 청소기 소스를보십시오. 솔루션은 4 어둠 속에서 ° C에 저장됩니다. </li><li> 원하는 라벨 기간 동안 쥐를 가장 먼저 thymidine이 포함된 솔루션을 (CldU 또는 이두)를 관리할 수 있습니다. 마우스가 레이블의 레이블이 지정되지 않은 기간 동안 물에 대한 액세스 권한을 허용하지 않습니다. 지정된 라벨 시대가 완료되면 (thymidine이 포함된 analogues 몇 시간의 혈청 하프 생활을) 적어도 24 시간 동안 레이블이 지정되지 않은 물로 막가는을 시작합니다. 원하는 라벨 기간 동안 생쥐에 두 번째 thymidine이 포함된 솔루션을 (CldU 또는 이두)를 관리할 수 있습니다. 리필 물 병은 정기적으로 탈수 방지! </li><li> 또는, 마우스는 CdlU 그리고 이두의 연속 intraperitoneal 주사로 분류하실 수 있습니다. 10mg / ML 농도에서 CldU이나 이두를 준비합니다. 이두는 정학에 가고 적극적으로 흔들어 다음 집중 수산화 나트륨 솔루션의 드롭 현명한 또한 필요할 수 있습니다. 초과 수산화 나트륨을 추가하지 마십시오. 이두의 10 ML 솔루션에 수산화 나트륨 한 방울 37 교반의 시간 다음 ° 통에 C를 추가합니다. 안 솔루션에 경우, 수산화 나트륨의 추가 반복합니다. intraperitoneal 우주로 g의 체중 당 100mcg를 주사. </li><li> 제어 슬라이드는이 프로토콜에 대한 필수적입니다. 결과적으로, 우리는 강력하게 조사가 감도와 특이성을 보장하기 위해 thymidine의 아날로그 라벨의 여러 변형을 수행하는 것이 좋습니다. 이들은 1 포함되어야합니다. 단 CldU와 라벨이 붙지만 마우스 2. 단 이두와 라벨이 붙지만 마우스 3. 순차적으로 CldU 그리고 이두와 라벨이 붙지만 마우스 4. 순차적으로 이두 그리고 CldU 처음에 역순으로 표시되었습니다 쥐, 물만으로 표시 모의 아르 5 쥐. CldU과 이두와 라벨 학습 때, 조사는 항상 관심의 조직에서 제어 슬라이드의 모든 5 위의 세트와 함께 전체 프로토콜을 수행한다. </li></ol> 2. 조직 하베스트, 고정 및 슬라이드 준비 <ol><li> 적절한 마취를 사용하여 치명적인 과다 복용을 수행하고 과다를 통해 마우스를 희생. 신선한 조직을 제거하고 24 시간 동안 4 4 % paraformalehyde ° C로 수정. 퍼가기 4에서 1시 4분 포르말린 버퍼와 저장 ° C로 조직을 전송합니다. </li><li> 또는 치명적인 과다 복용을 수행하고 혈액이 신체에서 해결이 될 때까지 생리 식염수로 왼쪽 심장 심실을 통해 마우스를 perfuse; 후 즉시 4 % paraformaldehyde의 30-50 CC와 perfuse. 퍼가기 4 ° C에서 1시 4분 포르말린 버퍼에 대한 관심과 저장소의 조직을 제거합니다. </li><li> 조직 탈수 및 파라핀의 포함 후, 5 미크론 조직 섹션 및 청구 슬라이드로 장소를 잘라. ° C 16시간에 대한 (아래 항원 검색 단계를 통해 필수) 슬라이드에 조직의 접착력을 보장하기 위해 65 슬라이드를 구워. </li></ol> 3. 탈수, Permeabilization 및 항원 불러오기 <ol><li> 5 분 두 크실렌 욕탕에서 슬라이드를 immersing하여 여분의 파라핀을 제거합니다. 각. </li><li> 100, 95, 90, 80 70 50 % 물로 희석 에탄올에 슬라이드를 immersing하여 조직을 Rehydrate. 3 분위한 슬라이드를 만끽해보세요. 각 농도에서 100 %로 시작하고 마지막 침수 50 %을 향해갑니다. </li><li> 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 1X PBS 인치 </li><li> 5 분 (신선한 때마다 만들어진)에 대한 0.2 % 트리톤 - X 솔루션에 슬라이드를 immersing하여 세포를 Permeabilize. </li><li> 마이크 로파 조직 항원 검색을위한 슬라이드를 준비합니다. 솔루션 증발 손실 계정에 슬라이드의 맨 위에 5cm를 다루고 있도록 충분한 볼륨 0.01M 산도 6.0 나트륨 구연 산염 버퍼와 유리 비커에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 솔루션 끓는 때까지 전자 레인지는 슬라이드 (30-10 분. 최대 전력으로). 솔루션은 서서히 끓는까지 전력을 절감 (10-80%)과 추가 20 분 동안 계속. 솔루션은 속도가 느린 종기로 유지하기 위해 정기적으로 전자 레인지를 확인합니다. </li><li> 플레이스 비커는 벤치 위에 슬라이드가 포함된 부드럽게 실온 (약 2 시간)로 냉각 수 있습니다. </li><li> 슬라이드가 온도계를 사용하여 실온에서 있는지 확인합니다. </li><li> 40 분 대한 1.5N HCL에 몰두 슬라이드. 상온에서. </li><li> 워시는 1X PBS, 5 분, 두 번 슬라이드. 세척 당. </li></ol> 4. 차 및 차 항체 <ol><li> 슬라이드가 전체 프로토콜을 통해 매우 촉촉한 유지하는 것이 중요합니다. 드라이 조직 훨씬 더 자동 것입니다- 형광, 결과 이​​미지가 사용할 수 없게 만드는. 한 번에, 프로세스 슬라이드 죽어 방지하기 위해. </li><li> (즉, 왁스) 펜을 차단 액체로 슬라이드에 서클 각 섹션을 참조하십시오. 1X PBS의 용기에 다시 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 서부 유럽 표준시 종이 타올을 배치하여 습기가 배양 챔버를 확인하는 것은 밀폐 플라스틱 용기의 바닥에 평평하게 하였다. </li><li> 1X PBS에 희석 10 % 당나귀 혈청 차단 솔루션을 확인하십시오. 완전히 솔루션의 각 부분을 커버하는 것이 중요합니다. 1 X 1.5 cm 아르 조직 섹션, 섹션마다 솔루션의 50 마이크로 리터 부피 충분합니다. </li><li> 슬라이드에 차단 솔루션을 추가합니다. 1X PBS에서 슬라이드를 제거하고 부드럽게 마른 종이 수건의 스택에있는 슬라이드 가장자리를 도청하여 여분 액체를 제거합니다. 플레이스 배양 챔버에서 슬라이드 각 섹션을 10 % 차단 솔루션을 50 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 슬라이드는 1 시간 동안 실온에서 가까운 컨테이너와 부화를 완료하는 경우. </li><li> 이두를 감지 차 항체 희석을 준비합니다. 1X PBS에서 만든 5% 당나귀 혈청에서 1:250 농도에서 마우스 방지 BrdU를 희석. 슬라이드에서 차단 솔루션을 누르과 배양 챔버에 다시 넣으십시오. 각 섹션에 위의 기본 항체를 추가하고 4 박 품어 ° C. </li><li> 높은 엄중 세척을 (CldU 마우스 방지 BrdU의 antisera하여 바인딩을 최소화)을 준비합니다. (; 산도 8.0 36mM 트리스, 50mM NaCl, 0.5 % 트윈 - 20) 신선한 낮은 소금 TBST 버퍼를 확인합니다. 당신은 슬라이드의 쌍 당 버퍼 40 ML이 필요합니다. 각 50 ML 원뿔 관에 버퍼 40 ML을 추가합니다. 슬라이드를 추가하기 전에, 37에 앞서 열을 가하다 솔루션 ° C. </li><li> 한 번에 두, 배양 챔버에서 슬라이드를 제거 (조직 샘플은 서로 떨어져 얼굴 있도록) 다시 - 투 - 다시 그들을 장소와 여분의 기본 항체를 누릅니다. 낮은 소금 TBST와 커버로 가득한 튜브에 슬라이드를 삽입합니다. 20 분위한 튜브를 선동. 37 온도와 박테리아 문화 배양기를 흔들어 ° C 및 225 RPM으로 설정 속도 인치 </li><li> 슬라이드에게 신선한 1X PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분. 세척 당. </li><li> 원하는 경우 CldU 및 조직 항원의 검출을 위해 다음 주 항체 솔루션을 준비합니다. 1X PBS에서 만든 5% 당나귀 혈청에서 1:250 농도에 쥐를 방지 BrdU를 희석. 기본 항체 용액으로 농도를 작업에 조직 항원에 대한 기본 antisera를 희석. </li><li> 슬라이드 초과 1X PBS를 탭 및 배양 챔버에서 그들을 놓으십시오. 각 섹션에 기본 항체를 추가하고 4 박 품어 ° C. </li><li> 슬라이드에게 신선한 1X PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분. 세척 당. </li><li> 보조 항체 솔루션을 준비합니다. Cy2 당나귀 방지 밀고 1:250와 Cy5 당나귀 방지 마우스 5 % 당나귀 혈청을 포함하는 1X PBS 솔루션 1:500로 희석. 조직 항원 antisera의 기본 종을 감지하기 위해 Cy3 보조 추가합니다. 또한, 보조 항체 용액에 1:150에 DAPI의 ML / 0.4mg 재고 솔루션을 희석. </li><li> 배양 챔버에서 초과 1X PBS의에서 슬라이드와 장소를 누릅니다. 각 섹션 차 항체 솔루션을 추가하고 실온에서 1 시간 품어. </li><li> 슬라이드에게 신선한 1X PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분. 세척 당. </li><li> 슬라이드 초과 1X PBS에서 탭과 골드 방지 페이드 설치 미디어 (dyanine 염료와 Vectashield를 사용하지 마십시오!) 연장과 커버 유리를 준수합니다. 공기 방울을 제거하기 위해 커버 전표를 누르십시오. 4 스토어 ° C. </li></ol> 5. 이미징 및 분석 <ol><li> 높은 에너지 광원, 계획 - apochromatic 목표, 그리고 고효율 현미경 카메라 (예 : 하마 마츠 오르카 ER)이 장착된 형광 현미경으로 이미지의 관심 조직을. AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (조직 항원)와 Cy5 (이두) 채널의 이미지를 캡처합니다. 단일 멀티 레이어 이미지 파일을 만들 이미지를 병합합니다. </li><li> 올바르게 수행할 경우, DAPI 스테인드 핵은 homogeneously 밝은 것입니다. 조직 항원 (예 : 인슐린)의 관심 세포를 공개해야합니다. DAPI이나 조직 항원과 얼룩 제거 커버 슬립과 보조 antisera의 응용 프로그램을 반복 숙박 1X PBS에 약하거나 일관성, 슬라이드 젖어있다면. </li><li> Cy3의 조직 항원에 중점을두고 있습니다. CldU와 채널 사이의 토글 Cy2와 Cy5 채널 이두의 얼룩을 확인합니다. 로 과도한 이두와 CldU 공동 양성로 표시 마커 사이에 잠재적인 상호 반응을 찾습니다. 단 CldU이나 이두를 포함하는 조직을 찾아보십시오. CldU 또는 이두 긍정적인 핵 부족 상표 또는 얼룩이있는 기술적인 문제를 나타낼 수 있습니다. 이 경우에는 매우 replicative 조직 (예 : 림프 노드)를 찾습니다. </li><li> 이미지를 분석. DAPI 및 조직 항원을 포함하는 레이어를 표시합니다. 지배적인 손에 화이트 보드 마커와 비 지배적인 손으로 셀 카운터를 사용하여 건조 삭제 표시 (일명 화이트 보드 마커)과 대조 마르크 각 핵을 표시합니다. 관심 조직 내에서 DAPI 긍정적인 세포를 계산합니다. 전체 셀 개수를 기록합니다. 흔적을 제거하는 건조 지우개를 사용합니다. 표시 계층S 포함 DAPI, 조직 항원 및 CldU. 관심 조직 내에서 CldU 긍정적인 세포를 계산합니다. 기록 CldU 셀 카운트하지만 마르크를 삭제하지 않습니다. 변경 조직 항원, CldU과 이두를 포함하는 레이어를 시각화하는 표시됩니다. 카운트 CldU 이두 두 긍정적인 세포. 기록의 가치, 모든 흔적을 삭제하고, DAPI, 조직 항원과 이두를 포함하는 레이어를 표시합니다. 관심의 조직 내에서 이두 긍정적인 세포의 총 수를 계산합니다. 기록 이두 셀 개수. </li></ol> 6. 대표 결과 우리는 순차적으로 즉각적인 희생 뒤에 2 주 1 주일 후 이두에 대한 CldU와 6주 오래된 여성 생쥐를 표시. Pancreata는 CldU, 이두, 그리고 인슐린 (조직 항원)뿐만 아니라 DAPI를 감지할 수 스테인드했다. 아일 레츠는 균일하게 인슐린 물들일되었습니다. CldU 스테인드 핵은 이두 스테인드 핵 (그림 2)에서 뚜렷한되었습니다. 아일릿 이외의 많은 핵이 CldU 이두 공동 긍정적인 (그림 2, 오른쪽 아래, 흰색 화살표)되었습니다. 하나의 인슐린 양성 세포는 CldU 및 이두 (그림 2, 오른쪽 아래, 마젠타 화살표) 모두에 대한 핵 얼룩했다. 쥐. 마우스로 모든 실험은 필라델피아의 어린이 병원의 IACUC위원회의 지침에 따라 수행되었다. 여성 B6.129 F1 야생 형 생쥐는 필라델피아의 어린이 병원에서 실험 동물 시설에서 지내게 타코닉 (제르 뉴욕), 그리고 PMI 영양 국제 (Richmond. 인디애나)에서 공급 마우스 국회 5,015에서 구입한했다. 전략을 레이블. 이두 (이 계획에 빨간색으로 표시)와 CldU와 함께 첫 번째 세포 분열 이벤트 (이 계획에 녹색 표시)와 두 번째 세포 분열을 라벨로, CldU 및 이두 (녹색 / 적색) 모두 공동으로 표시된 전지 순차 세포 분열 결과 . 마우스 내에서 췌장 세포 회전율의 thymidine 라벨링 대표 발생합니다. 중앙에 langerhans의 아일릿와 마우스의 췌장 Immunofluorescent 이미지. 마우스는 즉각적인 희생하기 전에 식수 2 주 동안 일주 그리고 이두에 대한 CldU로 주입했다. 프로토콜에서 설명한대로 췌장 샘플 처리되었습니다. 층이와 40x 객관적인 이미지, 계산에 적합한 표시됩니다. 병합된 이미지 DAPI (흰색) CldU (녹색), 이두 (적색), 인슐린 (노란색)이 포함되어 있습니다. (상단, 왼쪽)과 인슐린 DAPI. (상단, 오른쪽) CldU과 인슐린. (하단, 왼쪽) 이두와 인슐린. (하단, 오른쪽) CldU, 이두, 그리고 인슐린. 스케일 바 : 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 라벨링 전략. 이두 (이 계획에 빨간색으로 표시)와 CldU와 함께 첫 번째 세포 분열 이벤트 (이 계획에 녹색 표시)와 두 번째 세포 분열을 라벨로, CldU 및 이두 (녹색 / 적색) 모두 공동으로 표시된 전지 순차 세포 분열 결과 . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 이내 췌장 세포 회전율의 thymidine 라벨의 대표 발생합니다. 중앙에 langerhans의 아일릿와 마우스의 췌장 Immunofluorescent 이미지. 마우스는 즉각적인 희생하기 전에 식수 2 주 동안 일주 그리고 이두에 대한 CldU로 주입했다. 프로토콜에서 설명한대로 췌장 샘플 처리되었습니다. 층이와 40x 객관적인 이미지, 계산에 적합한 표시됩니다. 병합된 이미지 DAPI (흰색) CldU (녹색), 이두 (적색), 인슐린 (노란색)이 포함되어 있습니다. (상단, 왼쪽)과 인슐린 DAPI. (상단, 오른쪽) CldU과 인슐린. (하단, 왼쪽) 이두와 인슐린. (하단, 오른쪽) CldU, 이두, 그리고 인슐린. 스케일 바 : 100μm.

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</ol>

마우스로 모든 실험은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 필라델피아의 어린이 병원에서 동물 시설에서 수행되었다.

세포 회전율을 라벨에 thymidine 기반의 접근 방식에 대한 우리의 접근 방식은 생명 의학 연구에 많은 잠재적인 응용 프로그램을하고 있습니다. 지금까지 우리는 췌장에 집중해야하지만, 우리는 세포 피부의 매출, 뱃속, 간, 부신, 신장, testis, 난소, 갑상선, 림프절, 조혈 및 뇌 1 조사이 전략을 적용했습니다. 세포 회전율은 조직에서 조직 다양하기 때문에, 상표 전략은 이익의 기관에서 가장 뛰어난 정보를 얻을 정의해야합니다. 모리슨과 동료 일일 각각 조혈 2 라벨 위해 CldU과 이두를 사용합니다. 쿤과 동료 재생 myocardium 3 세포 분열을 감지하는 사일 각 CldU과 이두를 사용합니다. 반대로, 우리가 동물의 세 1,4-6과 같은 최소한의 세포 회전율과 췌장 아일 레츠 이내에 기저 세포 회전율, 조직을 라벨 총 9개월하는 CldU과 이두를 사용했습니다. 연구 조직의 항상성 내에서 세포 회전율을 정의하기위한 상표 전략의 가장 확실한 잠재적인 응용 프로그램입니다. 하지만 우리의 기술은 여러 가지 다른 가능성이 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 최근 증가 복제 초점 영역이 쉽게 CldU 또는 이두 5 증가 결합하여 식별할 수 조직 내에 종양 발생 변환을 식별하기 위해이 기술을 적용. 모리슨과 동료 일일 각각의 조혈 줄기 세포의 라벨 유지 행동 2 테스트하기위한 CldU과 이두를 사용합니다. 우리는 또한 대중 교통 - 확장의 세포가 조직 하나의 성장 또는 갱신에 기여하는지 확인하기 위해 순차 thymidine의 아날로그 라벨을 적용합니다. thymidine의 analogues이 응용 프로그램을 연속적인 행정 조직 항상성에 관련된 세포의 기원과 생존을 공부에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다. Thymidine의 analogues은주의없이 사용할 수 없습니다. 합성 thymidine의 analogues은 나누어 세포 잠재 toxicities을 가지고, 그들의 사용은 이론적으로 성장하는 동물 세포 회전율을 손상 수 있습니다. Thymidine의 analogues는 암 환자를위한 에이전트를 radiosensitizing로 사용되고 있고, 세포 회전율을 느리게 수 있습니다. 따라서 우리는 조심스럽게 관심을 자신의 조직에 잠재 toxicities에 대한 조사를 위해 조사를 촉구합니다. 예를 들어, Trumpp와 동료들은 체계적 BrdU는 조혈 줄기 세포는 세포주기 7 입력할 수 있으리란 걸 발견. 예를 들어, 러터와 동료 높은 선량의 thymidine analogues은 췌장 8 개발에 독성이있는 것으로 보여집니다. 최근 KineMed에서 Hellerstein와 동료, 병원은 BrdU 행정부가 독점적인 중수 라벨 기술 9를 사용 16~25%하여 내부 아일릿 확산을 느리게 것으로 나타났습니다. Hellerstein 및 동료에 의해 사용되는 전체 아일릿 준비 총 아일릿 준비 정도로 50 %를 구성하는 수 많은 다른 내분비 및 비 내분비 세포 유형을 포함. 그러나, 우리는 BrdU의 장기간 주입은 ki67 표현을 사 의한 측정으로, 젊은 성인 마우스의 베타 세포 증식에 영향을 미치지 않습니다 찾습니다. 마찬가지로, CldU 및 이두의 장기적인 관리는 베타 세포 대량 확장 1 손상하지 않는 것. 또한, 베타 세포 증식 속도는 시간과 단 몇 시간 (속도가 상당 기간에 정규화)을 표시 아르 생쥐의 오랜 기간 동안 BrdU으로 표시 생쥐 사이에 같습니다. 함께, 이러한 결과는 생쥐 안전하게 thymidine의 analogues의 장기 낮은 선량 관리를 용인할 수있는 것이 좋습니다. 아직도, 우리는 췌장 베타 세포의 성장에 thymidine analogues하여 잠재적인 독성을 배제할 수 없습니다. 결과적으로, 우리는 thymidine의 analogues와 마우스를 라벨링 때 컨트롤을 수행하고, 그러니 잘 다른 수사를 촉구하기 위해 계속합니다. 순차 thymidine의 아날로그 라벨 우리의 기술은 함정과 기술 도전없이는되지 않습니다. 결과적으로, 컨트롤 슬라이드 특히 중요합니다. 우리는 1 다양한 조직으로 이루어져 제어 슬라이드를 생성) 만 CldU와 라벨이 붙지만 마우스,.. 2)에만 이두와 라벨이 붙지만 마우스,. 3) 순차적으로 CldU 그리고 이두와 라벨이 붙지만 마우스,. 4) 순차적으로 이두 그리고 CldU 처음에 역순으로 표시되었습니다 쥐,. 물만으로 표시 모의 아르 5) 쥐. CldU과 이두와 라벨 학습 때, 조사는 항상 관심의 조직에서 슬라이드의 모든 5 위의 세트와 함께 전체 프로토콜을 수행한다. CldU과 이두 사이에 약간의 교차 반응 모두의 thymidine analogues와 라벨에 불행하지만, 부득 이한 단점입니다. CldU과 이두 기술은 원래 종 (마우스 및 쥐)에 BrdU에 대한 파생되었다 antisera 사이에 동질성의 차이에 따라 달라집니다. 우리 프로토콜은 복잡하면서, 이러한 교차 반응을 최소화하도록 설계되었습니다. 따라서, 우리는 프로토콜의 단계 (들)을 빼먹는 고려 조사 중에주의를 촉구합니다. 특히, 우리는있다마우스 및 쥐 사이에 교차 반응 아르 보조 antisera 문제가 발생했습니다. 이것은 완전히 마우스와 쥐 사이에 상호 adsorbed 아르 잭슨 antisera의 사용으로 최소화하실 수 있습니다. 우리는 때때로 적절하게 thymidine 결합을 감지하기 위해 실패합니다. 이러한 경우에 그것은 시약 또는 단계가 작동되지 않은 결정하기 위해 긍정적인 제어 슬라이드를 사용하는 매우 중요합니다. 문제는 일반적으로 antisera, 드라이 슬라이드, 또는 불충 분한 핵 permeabilization의 나쁜 aliquots 예정이다. 우리는 성공적으로 이두와 태아를 개발 라벨에 실패했습니다. 따라서, 모든 조직은 이두로 투과 수 있습니다. 이중 thymidine의 아날로그 라벨에 대한 CldU와 이두에 대한 대안이 수평선에있다. 이두 (5 - ethinyl - 2 deoxyuridine) 구리 촉매를 클릭 화학 감지 10,11위한 기판 수 있습니다. 에듀 검출 방법의 DNA 가닥이 분리를 요구하고, 유동세포계측법의 12 분석하므로 매우 의무가 없습니다 않습니다. 이두는 BrdU 10과 반응을 교차 호환되지만되지 않습니다. 이두는 췌장 베타 세포 13 장 L 세포 14 표피 15 등 다양한 마우스 조직의 세포 회전율을 계량하는 데 사용되었습니다. 에듀 순간 (500mg 당 천달러 미국)에 매우 비싼입니다. 하지만, 에듀 감지 훨씬 더 민감한 BrdU 검출 10 개 것 같습니다. 그러므로, 그것은 대신 CldU 및 이두의 이두와 BrdU을 결합하기 위해 경제적으로 가능 수 있습니다. 이 방법은 또한 triply 에듀, CldU, 그리고 이두에 대한 표시 마우스에서 세포 분열의 세 가지 다른 라운드의 감지를 허용 있습니다. 요약, 순차 thymidine의 아날로그 라벨 우리의 기술은 세포 회전율을 검출하는 새로운 접근 방식입니다. 우리는 우리의 접근 방식이 더 정확하게 세포 분열을 계량 다른 과학자들을 수 있도록 희망하고 조직 항상성의 새로운 패러다임을 열 것으로 기대합니다.

<table><tbody><tr><td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210547891</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210035701</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>10% 완충 포르말린 (Buffered Formalin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>자일렌 (XYLENES)</td><td>VWR international</td><td>EM-XX0060-4</td><td></td></tr><tr><td>무수 에탄올 (조직학용)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10X 분말 농축액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton &amp;#8211;X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>염산 (Hydrochloric Acid)</td><td>VWR international</td><td>BDH3028-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>정상 당나귀 혈청 (Normal Donkey Serum)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>Rat mab anti BrdU</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>OBT0030</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 donkey anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-225-153</td><td>Jackson 사의 완전히 흡착된 2차 항체 (교차 반응 최소화).</td></tr><tr><td>Cy5 donkey anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td>위 내용 참조</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9056-1CS</td><td></td></tr><tr><td>YFP 필터</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003 ET EYFP</td><td>Cy2 채널의 자가 형광 감소</td></tr><tr><td>Cy3 필터</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004 ET Cy3</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 필터</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49006 ET Cy5</td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER 현미경 카메라</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C4742-95-12ER</td><td>형광체 검출 성능 우수</td></tr><tr><td>ProLong Gold 항퇴색 시약 (antifade reagent)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Vectashield는 사용하지 마십시오 (시아닌 염료에 독성 있음).</td></tr></tbody></table>

기본 조직의 두 thymidine의 analogues의 immunofluorescent 검색 (cldu 및 이두)

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

세포 분열의 정확한 측정이 서서히 나누어 세포가 분석되면 점점 더 복잡해지는되어 실험 생물학의 근본적인 도전입니다. 세포 분열을 감지하기 위해 설립 방법은 세포 배양 등 carboxyfluorescein DI - aetate succinimidyl 에스테르 (CFSE) 같은 ki67 또는 PCNA와 같은 mitogenic 항원의 단백질 검출과 같은 중요한 염료의 희석하고, thymidine의 analogues 지속 현미경에 의해 직접적인 시각화를 포함합니다. Thymidine의 analogues는 tritiated thymidine, 브로모 - deoxyuridine (BrdU), 클로로 - deoxyuridine (CldU)와 iodo - deoxyuridine (이두)을위한 단백질 감지 및 ethinyl - deoxyuridine에 대한 화학 검출을위한 무선 감지를 포함한 다양한 방법에 의해 감지 수 있습니다 (이두). 우리는 성인 생쥐의 조직으로 다른 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 우리의 방법은 조사가 정확하게 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 수 있습니다. 최적화 immunostaining 프로토콜로 접근 시간이 연장 기간에 대한 마우스로 관리하는 안전한 식수를 통해 관리 매우 낮은 선량의 thymidine analogues를 검색할 수 있습니다. 따라서, 우리의 기술은 매우 긴 조직에서 세포 회전율을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 최적 immunofluoresent 얼룩 결과는 췌장, 피부, 뱃속, 간, 부신, testis, 난소, 갑상선, 림프절, 뇌를 포함한 여러 조직 유형에 형성될 수 있습니다. 우리는 또한 조직 내에 종양 발생 변환을 확인하려면이 기술을 적용했습니다. 우리는 더 이상 중계 - 확장의 세포 조직의 성장이나 갱신에 기여하는지 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 이러한 의미에서, thymidine의 analogues의 연속 행정 조직 항상성에 관련된 세포의 기원과 생존을 공부에 대한 새로운 접근 방식을 나타냅니다.

우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 - 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

세포 분열의 정확한 측정은 실험 생물학의 근본적인 과제이며, 세포 분열 속도가 느린 세포를 다룰 때 그 복잡성은 더욱 증가합니다.

안녕하세요. Calor D-U-I-D-U 염색 프로토콜에 오신 것을 환영합니다. 오늘 영상은 세 번째 단계인 재수화, 투과화 및 항원 회복부터 시작하겠습니다. 먼저 슬라이드를 캐리어에 장착하십시오.슬라이드 로딩이 완료되면, 자일렌 용액에 5분 동안 담가 둡니다. 이후 다시 자일렌 용액에 5분 동안 담그는 과정을 한 번 더 수행합니다.슬라이드를 100% 용액부터 시작하여 50% 용액까지 에탄올 용액으로 옮기며 재수화를 계속하십시오. 그 후, 세포막을 투과시키기 위해 슬라이드를 1X PBS에 5분 동안 담가 재수화를 완료합니다. 슬라이드를 0.2% Triton X 용액에 5분 동안 침지하십시오. 슬라이드가 완전히 잠기도록 충분한 양의 0.01 M sodium citrate buffer가 담긴 유리 비커에 넣어 마이크로웨이브 조직 항원 회수 준비를 하십시오. 이때 용액은 슬라이드 상단보다 5 cm 더 높게 채워져야 합니다.증발 손실을 보완하기 위해, 용액이 끓을 때까지 슬라이드를 전자레인지에 가열합니다. 최대 출력에서 약 3~10분 정도 소요됩니다. 슬라이드가 끓고 있는지 확인하십시오.마이크로웨이브 출력을 10에서 80% 사이로 낮추고 슬라이드를 20분 동안 천천히 더 끓입니다. 끓인 후, 슬라이드가 담긴 비커를 실험대 위에 놓아 상온에 도달할 때까지 약 2시간 동안 천천히 식힙니다. 슬라이드가 상온 상태인지 확인합니다.슬라이드를 상온에서 1.5 natural hydrochloric acid에 40분 동안 담급니다. hydrochloric acid에서 슬라이드를 꺼내 1x PBS 세척액에 5분 동안 둡니다. 그 다음 두 번째 1x PBS 세척을 수행합니다.액체 블로킹 왁스 펜을 사용하여 1x PBS 접근 용액에서 슬라이드를 꺼냅니다. 각 조직 절편에 원을 그린 후 슬라이드를 다시 PBS에 넣습니다. 밀폐 용기 바닥에 젖은 종이 타월을 깔아 습윤 배양 챔버를 만듭니다.1X PBS에 10% docking serum을 희석하여 블로킹 용액을 조제하십시오. 약 1 × 1.5 cm 크기의 일반적인 조직 절편의 경우, 각 절편이 용액으로 완전히 덮이도록 하는 것이 중요합니다. 50 µL의 블로킹 용액이면 충분합니다.마우스 anti BRDU 항혈청을 5% donkey serum에 희석하여 1차 IDU 항체를 준비합니다. 희석 배율은 1:250으로 합니다. 준비된 1차 항체 용액을 각 슬라이드 섹션 위에 피펫으로 분주합니다.슬라이드를 4°C 냉장고에 보관하십시오. 밤새 배양하는 경우, 고엄격도 세척액을 준비하십시오. TBST가 적합합니다.슬라이드를 서로 등지게 배치합니다. 슬라이드를 약 35~40 milliliters의 TBST Solution에 넣습니다. 튜브를 37 degrees Celsius의 진탕 배양기(shaking bacterial culture incubator)에 넣습니다.225 RPM으로 20분 동안 흔들어 줍니다. 이제 슬라이드를 캐리어에 적재하십시오. 슬라이드를 XPBS에 넣고 5분 동안 PBS 세척을 수행합니다.이어서 XPBS로 5분 동안 2차 세척을 수행합니다. 5% donkey serum으로 rat anti BRDU를 희석하여 1차 CLDU 항체 용액을 준비합니다. 1:250 농도로 첨가한 후, 슬라이드를 페이퍼 타월 위에 놓고 왁스 펜으로 구획을 표시합니다.피펫을 사용하여 각 조직 절편을 1차 CLDU 용액으로 덮습니다. 모든 조직 절편이 완전히 덮이도록 약 50 µL의 용액을 사용하십시오. 슬라이드를 4 °C 냉장고에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다.슬라이드를 캐리어에 넣은 후 1×PBS 세척액에 5분 동안 담가 둡니다. 슬라이드를 두 번째 1×PBS 세척액에 옮겨 다시 5분 동안 담가 둡니다. CY2 donkey anti-RAD 및 PS5 donkey anti-mouse 항체를 5% donkey serum에 희석하여 2차 항체를 준비합니다. 핵 염색을 위해 DPI도 사용하며, 조직 절편이 2차 항체로 완전히 덮이도록 도포합니다.조직을 완전히 덮기 위해서는 50 µL의 용액이면 충분합니다. 재수화 챔버를 실온의 어두운 곳에 두고 1시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 캐리어에 넣은 후, 5분 동안 1회 XPBS 세척을 수행하십시오.슬라이드를 두 번째 1×PBS 세척액에 5분 동안 담급니다. 종이 타월을 사용하여 과량의 PBS 용액을 톡톡 쳐서 제거합니다. 그런 다음 Prolong Gold 항퇴색 마운팅 용액을 가져와 각 조직 절편 위에 소량씩 떨어뜨립니다.커버 슬립을 집어 슬라이드 절편 위에 조심스럽게 덮습니다. 페이퍼 타월을 누름판으로 사용하여 슬라이드 절편과 커버 슬립 사이에 갇혀 있을 수 있는 과잉 기포를 밀어내어 제거합니다. 마지막으로, 피펫 팁을 사용하여 남아 있을 수 있는 과잉 기포를 밀어내어 제거합니다. 고에너지 광원과 다중 형광 채널이 장착된 형광 현미경을 사용하여 분석 대상 조직의 이미지를 획득하고 결과를 정량화합니다.먼저 Dabi 양성 세포의 수를 측정합니다. SI 2채널 이미지를 사용하여 CLDU 양성 세포의 수를 측정합니다. SCI 5채널 이미지를 사용하여 IDU 양성 세포의 수를 측정합니다.마지막으로, SCI two 채널 이미지 파일과 SCI five 채널 이미지 파일을 번갈아 확인하며 이중 양성 표지 세포의 수를 측정하십시오.

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연구

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생물학

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