ربط المسابر البيولوجي لأجهزة الاستشعار البصرية عن طريق وكلاء السيليكا اقتران silane

الهدف العام من هذا الإجراء هو تغطية سطح المرنان البصري المجهري السيليكوي بالبيوتين من خلال عملية التعلق التساهمي دون إضعاف حساسية الجهاز. يتم تحقيق ذلك من خلال عملية من ثلاث خطوات ، بدءا من الهيدروكسيل باستخدام بلازما الأكسجين أو هيدروكسيل حفر بيها يتبعه الانبعاث من خلال ترسيب بخار عامل اقتران السلان. ثم يتم تنفيذ البيوتين باستخدام كيمياء NHS Ester لربط السلسلة الجانبية للبيوتين بالوسائل الأولية على سطح الرنان.

في النهاية ، تنشئ هذه الطريقة مستشعر حيويا بصريا شديد الحساسية ومحددا لجزيء ذي أهمية ، ويمكن تعديله بشكل أكبر من خلال وضع العلامات الفلورية على السيليكا المنتهية ، وكذلك من خلال طريقة تعقيد البيوتين في Ava tin لإنشاء منصة استشعار حيوي لمجموعة واسعة من الأهداف المحتملة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لوظائف السطح ، مثل الامتصاص المادي ، هي أن جزيء المسبار الخاص بنا متصل تساهميا ، مما يجعل مستشعراتنا أكثر قوة وموثوقية. هذا يعني أنه يمكن تخزينها لفترات أطول من الوقت مع الاحتفاظ باستخدامها ، وتظل حساسة للغاية بعد تشغيلها.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب صعوبة التعامل مع أجهزة الحجم الصغير طوال عملية الوظيفية. تقنية المناولة السيئة هي أسهل طريقة لتدهور الأداء البصري للمستشعر وتوليد تلوث على سطح المستشعر باستخدام المقص. قطع قطعة من الورق المقوى بسمك ربع بوصة إلى بوصة واحدة في بوصة مربعة.

قم بلصق هذا على شريحة زجاجية قياسية وقم بإرفاق قسم بوصة واحدة من الشريط اللاصق المدلفن بالورق المقوى. هذا يخلق منصة يمكن من خلالها رفع الكرة المجهرية وعزلها عن البيئة المحيطة ويمنع تلف سطحه باستخدام المقص. قطع قسم ثلاثة بوصات من الألياف الضوئية من التخزين المؤقت.

بعد ذلك ، استخدم أداة تجرد الألياف بدون لتجريد الطلاء البوليمري الواقي من آخر 0.5 بوصة في نهاية قطعة الألياف المقطوعة ، مع ترك قلب السيليكا فقط ، وتنظيف سطح أي بوليمر متبقي باستخدام مسح كيم مبلل بالميثانول عن طريق مسح الألياف برفق باستخدام ساطور ألياف مكشوف لقص الطرف المجرد بحيث يبقى حوالي ملليمتر واحد فقط من الألياف المجردة في نهاية الليف. ضع الطرف المجرد من الألياف الضوئية في مسار ليزر ثاني أكسيد الكربون مع العناية عموديا. قم بمحاذاة الألياف بحيث يكون نهايتها المجردة متجها لأسفل.

قم بتشغيل ليزر ثاني أكسيد الكربون وتوجيهه إلى سطح الطرف المجرد للألياف الضوئية. سيقوم الليزر بإذابة الطرف المجرد من الألياف في كرة باستخدام ما يقرب من 3.5٪ من الطاقة في ثانيتين. باستخدام الملقط ، أمسك بعناية جذع الكرة المجهرية.

قم بتوصيل الجذع بلفة الشريط على غلاف الكرة المجهرية. يمكن تخزين الشريحة الزجاجية في طبق بتري ، مما يسمح بالتخزين الآمن للكرة المجهرية في قارورة بولي بروبيلين سعة 60 مليلتر بغطاء مفصلي. قم بإعداد محلول سمكة الضاري المفترسة عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من بيروكسيد الهيدروجين إلى القارورة ، متبوعا بسبعة ملليلتر من حمض الكبريتيك المدخن.

انقل الشريحة الزجاجية التي تحمل كرة مجهرية واحدة على الأقل إلى القارورة. يجب أن يكون الكرة المجهرية ملامسا للسائل ، لكن يجب ألا يلمس السائل الورق المقوى. اضبط حجم المحلول إذا لزم الأمر.

بعد غمر الكرات في محلول سمكة البيرانا لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من القارورة وأدخلها في قارورة بلاستيكية أخرى تحتوي على ماء مقطر منزوع الأيونات. ضع القارورة على درج الإمالة لمدة خمس دقائق بزاوية خمس درجات وسرعة الإمالة خمس دورات في الدقيقة. قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من القارورة وضعها في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

لتجفيف السطح ، ضع الشريحة الزجاجية التي تحتوي على كرة مجهرية واحدة على الأقل في فراغ. جفف. افتح زجاجة عامل اقتران السلان ، مثل A-P-T-M-S وضع الزجاجة المفتوحة في المجفف. استبدل الغطاء الموجود على المجفف الفراغي وقم بتوصيل منفذ المخرج بشفاط أو خط تفريغ منزلي.

قم بتشغيل المنزل أو المكنسة الكهربائية أو خط الماء وإخلاء الفراغ المجفف. بمجرد تشكيل ختم فراغ بين الغطاء والقاعدة ، ابدأ في توقيت التفاعل. سيؤدي ذلك إلى إيداع عامل اقتران الجيب على السطح كغشاء رقيق.

بعد 15 دقيقة ، قم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية وافتح المنفذ ببطء للسماح للهواء بالدخول إلى الجفاف. بالنسبة لعامل التوصيل هذا ، تكفي 15 دقيقة لتشكيل طبقة أحادية موحدة على السطح لعوامل التوصيل الأخرى. قد يحتاج الوقت إلى تعديل ساعة واحدة تقريبا قبل توصيل البيوتين ، وإعداد محلول 10 ملليمولار من بيوتين أكسيد الهيدروكسيل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي في قارورة بولي بروبيلين سعة 60 مليلتر مع غطاء مفصلي.

أصعب جزء في هذا البروتوكول هو التعامل مع الكرة المجهرية وتجنب تلوث سطح الكرة من أجل ضمان النجاح. بالإضافة إلى إنشاء جهاز الشرائح لعقد الكرات ، يتم صوتنة محلول البيوتين مسبقا لتفتيت الجسيمات المتبقية على السطح. قم بتصنيع المحلول لمدة ساعة لإذابة مسحوق البيوتين NHS بالكامل في المذيب.

انقل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الكرة المجهرية إلى قارورة بلاستيكية أخرى مع الكرة المجهرية في الأسفل والجذع في الجزء العلوي من القارورة. باستخدام ماصة بلاستيكية ، انقل حجما مناسبا من محلول البيوتين NHS إلى أسفل جانب القارورة خلف الشريحة الزجاجية بحيث لا يلمس المحلول الكرة المجهرية أثناء إضافته إلى القارورة. أضف حلا كافيا لتغطية سطح الكرة المجهرية.

ضع القارورة التي تحتوي الآن على محلول MICROSPHERE و NHS biotin و DMSO على حاضنة هزاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع سرعة وزاوية إمالة عند خمس دورات في الدقيقة وخمس درجات على التوالي. قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من القارورة وحركها برفق في قارورة أخرى مملوءة بالماء المقطر منزوع الأيونات. ضع القارورة على صينية الإمالة لمدة 10 دقائق أخرى بنفس السرعة وزاوية الإمالة.

كما كان من قبل ، كرر هذه الخطوة مرتين بالماء العذب في كل مرة. يساعد هذا في إزالة DMSO الزائد من السطح ويزيل أي بيوتين ممتص جسديا لم يتم تطعيمه على السطح. أخرجي الشريحة الزجاجية من القارورة وضعيها في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى تتم إزالة جميع قطرات الماء من السطح.

تابع إجراء وضع العلامات الفلورية على السيليكا المنتهية المتوسطة كما تمت مناقشته في البروتوكول بالفلورسنت. قم بتسمية السيليكا المنتهية بالبيوتين. أولا ، قم بإعداد محلول 10 ميكروغرام لكل مليلتر من Texas Red Aden في محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

أضف المحلول إلى قارورة بولي بروبيلين سعة 60 ملليلتر بغطاء مفصلي وحرك الشريحة الزجاجية التي تحتوي على كرة مجهرية منتهية بالبيوتين برفق في المحلول بحيث يتم تغطية الكرة المجهرية بالمحلول فقط. ثم لف القارورة والرقائق بعد تفاعل لمدة 30 دقيقة. تتم إزالة الوقت في درجة حرارة الغرفة في الظلام الزائد من الفلورو الرابع من خلال شطفتين لمدة 10 دقائق من الكرة المجهرية في المخزن المؤقت PBS.

كما كان من قبل ، املأ قارورة بولي بروبيلين سعة 60 مل بالمخزن المؤقت وانقل الشريحة الزجاجية برفق إلى المحلول. اعتني بذلك. يغطي الحل فقط الكرة المجهرية وليس غلاف الورق المقوى.

قم بتغطية القارورة بورق الألمنيوم وضع القارورة على صينية إمالة مضبوطة على الصاروخ خمس درجات وخمس دورات في الدقيقة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من القارورة وحركها برفق في قارورة أخرى مملوءة بالماء المقطر منزوع الأيونات ومغطاة بورق الألمنيوم. ضع القارورة على صينية الإمالة لمدة 10 دقائق أخرى بنفس السرعة وزاوية الإمالة.

كرر هذه الخطوة مرتين بالماء العذب في كل مرة. هذا يساعد على إزالة الصبغة الزائدة من السطح. كخطوة أخيرة ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية بشكل عام من القارورة وجففها في فرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل التصوير.

إذا تم إجراء وظائف السطح بشكل صحيح ، فيجب أن يؤدي ذلك إلى تغطية كثيفة بشكل موحد لجزيئات البيوتين على السطح كمسبار بواسطة المجهر الفلوري. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يظل السطح خاليا من العيوب والملوثات بعد الوظيفة من أجل الحفاظ على حساسيته العالية. أثناء تجارب الكشف كما هو موضح بواسطة الفحص المجهري البصري الموضح هنا أمثلة على الكريات المجهرية التي تعمل بشكل صحيح.

تظهر هذه الصور أنه لا يوجد تلف أو تلوث على السطح بسبب الوظيفية ، وأن الكريات المجهرية تظهر تغطية متسقة موحدة إما لمجموعات متوسط أو مجموعات البيوتين. على السطح ، إذا لم يتم تشغيل الكريات المجهرية بشكل صحيح ، فستظهر صور الكرة المجهرية الضوئية تلوثا على السطح أو تغطية متكتلة أو غير منتظمة وعيوب واضحة في السطح مثل الشقوق السطحية الموضحة هنا هي مثال شائع على تلوث السطح الناتج عن تكتل الكواشف على السطح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل سطح أي مرنان بصري للسيليكا مع البيوتين.

نظرا لأن هذه طريقة عامة لأجهزة السيليكا ، يجب أن تكون قادرا على تطبيقها على نطاق واسع على العديد من الأنواع المختلفة من منصات استشعار السيليكا. من خلال تطورات هذه التقنية ، سيتمكن الباحثون في مجال الضوئيات الحيوية من استكشاف طرق جديدة ومجموعات مستشعرات مسبار جديدة بسهولة أكبر لإنشاء منصات استشعار حيوية عالية الحساسية ومحددة.