관절염에 Progranulin의 보호 역할을 조사하기 위해 마우스의 수술로 유발 된 모델 구축

이 절차의 전반적인 목표는 마우스에서 DMM 모델을 만들고 DMM 수술 후 골관절염의 발병을 연구하는 것입니다. 동물을 준비한 후 무릎 관절을 노출시키기 위해 1cm 길이의 내측 파라 슬개골 절개를 만듭니다. 다음으로, 무릎 관절낭을 절개하고 무릎의 내측 탈구를 수행합니다.

마지막 단계는 내측 반월상 연골 경골 인대를 절단하고 무릎을 봉합하는 것입니다. 궁극적으로, 조직병리학적 분석은 관절 구조의 파괴와 protio, glycan 및 골관절염의 손실을 보여주는 데 사용됩니다. 중증도는 MANKIN 사프란 점수와 o 염색을 사용하여 평가합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생쥐에서 수행되는 수술을 않는 한 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 자세한 단계를 배우기가 어렵고 이제 현미경으로 수행되기 때문에 무릎 관절의 모든 구조를 명확하게 인식해야 합니다.

이 모델을 확립하기 위해 약 25g의 8-12주 된 수컷 C 57 블랙 식스 마우스를 마취하여 내측 반월상 연골 또는 DMM 수술의 불안정화를 준비합니다. 그런 다음 무릎 주변을 면도한 후 눈에 안과 연고를 바르십시오. 베타딘과 알코올로 사이트를 세 번 소독하고 외과적으로 해당 부위를 드레이프합니다.

무릎 관절을 노출시키기 위해 1cm 길이의 내측 파라 슬개골 절개를 만들어 수술을 시작합니다. 그런 다음 대퇴골이 노출될 때까지 내측 파라 슬개골 절개를 통해 무릎 관절낭을 세로로 조심스럽게 자릅니다. 다음으로, 집게를 사용하여 절단을 더 넓고 깊게 만들어 캡슐 구조를 느슨하게 합니다.

뒷발의 말단 부분을 한 손으로 부드럽게 잡습니다. 집게를 사용하여 슬개골과 슬개골 인대의 측면 탈구를 수행합니다. 관절낭이 세로로 절단된 경우 탈구에 많은 힘이 필요하지 않아야 하며, 수술의 나머지 기간 동안 관절 연골 표면에 멸균 식염수를 떨어뜨려 건조를 방지합니다.

이제 대퇴골의 내측 과두와 경골의 내측 고원 사이에 위치한 내측 반월판을 확인합니다. 필요한 경우, 반월상 연골 경골 인대를 덮고 있는 지방 패드를 옆으로 당겨 내측 반월판의 측면을 경골의 과두간 돌출부에 연결하는 반월상 연골 경골 인대를 노출시킵니다. 뒷발을 한 손으로 부드럽게 잡습니다.

10번 수술 칼날로 내측 반월상 연골 경골 인대를 조심스럽게 절개하여 DMM 수술을 수행합니다. 관절 연골이나 다른 인대를 다치지 않도록 하십시오. 다음으로, 6 aut 흡수성 봉합사로 무릎 관절 캡슐을 닫고 6 aut 실크 봉합사로 피부를 닫습니다.

수술 후 통증을 최소화하기 위해 멜록시캠 1kg당 10mg을 피하 주사하고 마취가 끝난 후 쥐를 케이지로 되돌립니다. 수술 후 몇 주 후에 마우스를 희생하고 숫자 10 블레이드로 양쪽 뒷다리를 제거합니다. 그런 다음 뒷다리의 피부와 근육을 조심스럽게 절개하고 샘플을 실온에서 3일 동안 4% 파라폼 알데히드로 고정합니다.

3일 후, 파라폼 알데히드를 제거하고 증류수에서 3분 동안 샘플을 세척합니다. 그 후, EDTA에서 샘플을 섭씨 4도에서 2주 동안 석회질 제거한다. 2주 후, 에탄올 그라디언트에서 샘플을 탈수합니다.

최종 에탄올을 제거한 후 샘플을 3개의 렌 욕조에 각각 1시간씩 넣습니다. 다음으로, 샘플을 파라핀 몰드에 넣습니다. 회전식 마이크로톰을 사용하여 5미크론 절편을 만들고 유리 슬라이드에 절편을 수집합니다.

외측 과두의 중심에서 내측 과두의 중심까지 연속적인 시상 절편을 계속 절단하여 사프란 및 O 염색을 수행합니다. 먼저 셀린느에서 3분에서 5분 동안 슬라이드를 그립니다. 셀린느 목욕을 두 번 반복합니다.

그런 다음 증류수로 끝나는 에탄올 그라디언트로 슬라이드를 수화합니다. 그런 다음 Weigert의 철 헤마틴 용액, 0.05% 고속 녹색 용액, 1% 아세트산 용액, 0.1% 사프란 및 O 용액을 통해 슬라이드를 놓습니다. 이제 수지 매체를 사용하여 슬라이드를 장착하고 연골에서 빨간색 프로트 글리칸 색상의 손실과 연골 구조의 파괴 비율에 따라 사프란 및 O 염색된 슬라이드에 점수를 매깁니다.

그런 다음 O-A-R-S-I 조직학적 채점 시스템을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 그들 이 이미지는 가짜 수술 또는 DMM 수술 후 8주 후에 야생형 및 PG rrn 녹아웃 마우스에서 사프란과 O 염색이 있는 무릎 관절을 보여줍니다. 가짜 수술 후 두 유전자형 모두에서 연골의 명백한 퇴행은 없습니다.

그러나 DMM 수술 8주 후, 연골의 붉은 색 소실에서 알 수 있듯이 프로티오 글리칸이 손실되었고, 야생형 마우스와 PGRN 녹아웃 마우스 모두에서 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이 연골 구조가 파괴되어 골관절염 표현형이 성공적으로 유도되었음을 나타냅니다. DMM 수술 후, 야생형과 PGRN 녹아웃 마우스의 골관절염 점수 비교. DMM 수술 후 녹아웃 마우스에서 상당히 높은 점수를 보여주며, 이는 PGRN의 손실이 더 심각한 골관절염 표현형 As 마스터로 이어졌음을 보여줍니다.

이 기술은 제대로 수행되면 10-15 분 안에 완료 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 DMM 작업을 대량으로 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.