Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

본 실험 절차의 전반적인 목적은 랑고(langor) 방식으로 관류된 토끼 심장에서 광학 매핑 기술을 사용하여 전도, 재분극, 부정맥 유발 및 칼슘 처리와 같은 심장 전기생리학적 특성을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 온전한 토끼 심장을 적출하여 대동맥을 통해 역행성으로 관류합니다. 그다음 단계로 심장 표면을 노출시키고, excitation contraction on Coler BLEs statin을 사용하여 심장 수축을 정지시킨 후, 전압 민감성 및 칼슘 형광 지시약을 사용하여 심근을 적절히 염색합니다.

그런 다음 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 심실 심외막의 상당 부분에서 광학 활동 전위 기록을 수행합니다. 이후 광학 신호를 재구성된 심장 심외막 표면의 3D 기하학적 구조에 매핑합니다. 이 단계에서 비파노라마 듀얼 이미징 시스템을 사용하여 광학 활동 전위와 칼슘 과도 현상을 동시에 기록할 수 있습니다.

본 절차는 규칙적인 리듬뿐만 아니라 심방 및 심실 부정맥 동안 분석 가능한 심근의 공간적 및 시간적 흥분과 재분극, 그리고 칼슘 핸들링의 일치하는 특성에 대한 정량적 데이터를 제공합니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 워싱턴 대학교의 의생명공학 교수인 Iger Eov 박사입니다.

오늘 저희가 소개할 광학 기술은 기존의 마이크로 전극 및 마이크로 전기도표법(electrograms)에 비해 여러 가지 장점을 가진 독보적인 기술로, 수십, 수만 개의 활동 전위와 칼슘 과도 현상(calcium transients)을 동시에 기록할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 모든 전기도표법으로 기록되는 활동 전위를 심하게 왜곡시키는 전기 자극 및 제세동으로 인한 아티팩트(artifacts)의 영향을 받지 않습니다. 더불어, 칼슘 과도 현상은 오직 이 기술을 통해서만 기록될 수 있습니다.

다른 대안이 없습니다. 이 방법은 치명적인 심방 및 심실 부정맥의 유도, 유지 및 종료 기전뿐만 아니라 선천성 심장 질환, 대사 질환 및 심부전과 같은 질병에서의 전도 및 흥분-수축 결합의 기능 모델링과 같이 심장 전기생리학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수술 준비가 완료되면 소듐 펜토바르비탈과 헤파린 혼합액으로 토끼를 안락사시킵니다.

토끼가 통증 반사에 반응하지 않는 즉시, 흉부를 열고 심장과 폐를 적출합니다. 대동맥궁의 모든 분지 전 상행 대동맥의 상단부를 절개한 후, 비재순환 LRF 관류 시스템의 펌프를 가동하여 Tyro 용액이 흐르도록 합니다. 심장을 LOR 관류 시스템과 연결된 16게이지 대동맥 캐뉼라에 빠르게 장착합니다.

대동맥 내의 공기를 모두 밀어내고, 관류가 완전히 이루어지면 대동맥 캐뉼라를 결찰합니다. 지체 없이 심낭을 절개하십시오. 그 후 심장을 둘러싸고 있는 폐 기관지 지방과 결합 조직을 제거합니다.

허혈을 유발할 수 있는 좌심실 내의 액체 축적을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 따라서 실리콘 배액관을 폐정맥과 이첨판을 통해 좌심실로 삽입하십시오. 이제 캐뉼라가 연결된 심장을 광학 매핑 시스템이 장착된 재순환 Langendorf 관류 시스템으로 이동시키십시오.

심장을 맞춤 제작된 육각 챔버에 넣고 캐뉼라를 관류 시스템에 연결합니다. 압력 트랜스듀서를 사용하여 대동맥압을 모니터링하며, 관류 펌프의 유량을 조절하여 압력을 60 ± 5 mmHg로 유지합니다. pH는 7.35 ± 0.05 정도로 유지합니다.

실내 조명을 끄고 캐뉼라 상단에 위치한 기포 제거기의 주입구를 통해 빛에 민감한 BLEs statin 스톡 용액을 천천히 주입합니다. 10 µM의 BLEs statin 농도에 도달하려면 0.1 mL의 BLEs statin을 천천히 주입하십시오. 매회 볼러스 주입 시, 다음 주입 전 압력이 안정될 때까지 기다립니다.

포토다이오드 어레이(PDA)를 심장 주변으로 3등분 된 각도에 배치합니다. 그런 다음 각 PDA에서 심장의 이미지가 이미지 평면의 프로스티드 글라스(frosted glass)에 초점이 맞도록 조절합니다. 심장이 세 개의 PDA 모든 시야에 들어올 때까지 육각형 챔버 내 캐뉼라의 위치와 각 PDA의 위치를 조정합니다.

그 후, 무광 유리에 투영된 각 초점 이미지의 사진을 찍습니다. 공기 방울 트랩의 주입구를 통해 D four Anep 스톡 용액 10 to 20 µL를 관류액에 천천히 주입합니다. 그리고 3분 동안 기다립니다.

다음으로, 페이싱 전극을 원하는 위치에 조심스럽게 배치합니다. 여기서는 심장의 전면부 중앙에 배치하였습니다. PDA로부터 광학 기록을 동시에 시작합니다.

광학 신호에 움직임으로 인한 아티팩트가 없으며, 후속 데이터 분석을 위해 신호 대 잡음비가 충분한지 확인하십시오. 완료되면 실내 조명을 켜고, PDA 중 하나의 위치에 설치된 카메라를 사용하여 10도 회전할 때마다 사진을 한 장씩 촬영하여 심장의 사진 기록을 남기십시오. 그런 다음 관류 시스템의 세척을 진행하십시오.

캐뉼라가 삽입된 심장을 라운드 글라스 챔버에 넣고 캐뉼라를 관류 시스템에 연결합니다. 심장의 심실 첨부와 심방 부위를 핀으로 고정하여 챔버의 실리콘 바닥에 고정합니다. 심장을 부동화하기 위해 실내 조명을 끄고, 용액 표면의 움직임을 줄이기 위해 주입구를 통해 BLEs statin을 천천히 주입합니다.

심외막 표면 위에 유리 윈도우 커버를 놓습니다. 이 절차 단계는 보통 암실에서 수행되지만, 여기서는 밝은 곳에서 진행하고 있습니다. 비디오 영상을 개선하기 위해 이중 이미징 시스템을 심장 위로 이동시킵니다.

이제 두 CMO 카메라의 초점을 동일한 시야에 맞춥니다. 다음으로 여기 필터가 장착된 두 개의 할로겐 램프 광가이드를 배치합니다. 주입구를 통해 10 to 20 µL의 전압 민감성 염료 RH 2 37을 첨가하여 심장을 염색합니다.

그런 다음 버블 트랩 포트를 통해 1:1 혼합 비율의 road 2:00 AM과 onic F1 27 200 µL를 추가합니다. 매핑을 시작하기 전, road 2:00 AM의 DS ification이 이루어질 수 있도록 약 20분 동안 대기합니다. 이제 테스트 녹화를 수행합니다.

용액 표면의 움직임을 방지하기 위해 슈퍼퓨전 펌프를 끕니다. 할로겐 램프를 켜고 양쪽 카메라에서 광학 기록을 수행합니다. 그런 다음 여기광을 끕니다.

초과관류 펌프(superfusion pump)를 켜고 광학 신호의 품질을 확인하십시오. 신호가 약한 경우, RH 2 37 및 road 2:00 AM을 추가하여 심장을 다시 염색하십시오. 모션 아티팩트(motion artifact)가 발생하는 경우, BLEs statin을 추가로 투여하여 움직임을 제거하고 모든 상태가 정상인지 확인하십시오. 계획된 실험을 진행하고 시스템을 정리하십시오.

작업이 완료된 후, 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 Lang Endorf 방식으로 관류된 토끼 심장의 전면도를 나타냈습니다. 이와 비교하여, 심장 기하학적 구조의 재구성 모델은 동일한 전면도를 보여줍니다. 여기에 표시된 펼쳐진 심외막 표면은 위상별로 색상 코딩되었습니다.

심장은 로터 주변의 5개 위치에서 빈맥성 부정맥(tachy arrhythmia) 삽화를 겪고 있었습니다. 광학 활동 전위가 제시되었습니다. 여기 빨간색으로 표시된 것은 안정적인 재진입 부정맥(reentrant arrhythmia) 주기 동안 전파되는 활성화 파면입니다.

파면이 심장의 전면 표면에 있는 위상 특이점(phase singularity)을 중심으로 시계 방향으로 회전합니다. 심장 후면 표면의 파면을 시각화하기 위해 재분극은 투명한 파란색으로 표시되었습니다. 심장은 활동 전위와 칼슘 과도 현상의 동시 매핑을 보여주기 위해 이중 매핑 시스템을 사용하여 분석되었습니다.

단일 지점의 기록을 근접 촬영한 모습으로, 파란색은 활동 전위를, 빨간색은 칼슘 과도 현상을 나타냅니다. 이 전면도에 표시된 점들과 같이 일정 간격으로 배치된 지점들에서 수집한 샘플 트레이스 배열이 표시되어 있습니다. 이 데이터는 픽셀당 200 microns by 200 microns의 광학 해상도로 수집되었습니다.

전기치료 중에 강한 전기 자극의 효과를 직접 시각화할 수 있으므로, 이 치료법의 영향은 심방 및 심실의 10 K 부정맥에 대한 제세동 치료로 확대됩니다. 이를 수행할 수 있는 다른 대체 방법은 없습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 심방세동 및 심실빈맥을 위한 새로운 저전압 무통증 제세동 치료법을 개발하고 검증했습니다.