Name: Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 Langendorff 관류 토끼 심장에서 다중 광학 매핑 기술을 활용한 심장 전기생리학 연구 방법을. 이 기법은 심실 재분극 및 칼슘 처리 메커니즘을 정량적으로 분석하여 부정맥 발생 원인을 규명하는 데 활용됩니다.

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1. 준비 <ol><li> 갓 만든 Tyrodes '솔루션을 (㎜, 128.2 NaCl, 1.3 CaCl 2, 4.7 KCl, 1.19 아니 2 PO 4, 1.05 MgCl 2, 20.0 NaHCO 3, 11.1 포도당)을 준비합니다. 솔루션의 매일 준비를 신속히하기 위해 사전에 두 재고 솔루션을 준비하고 4에 그들을 저장할 ° C 냉장고 : (1) 주식 I (g/2L에서 374.6 NaCl, 9.56 CaCl 2, 17.52 KCl, 8.21 아니 2 PO 4 , 10.67 MgCl 2) 및 (2) 주식 II (g/2L에서 84.01 NaHCO 3). 한 실험이 걸릴 충분한 Tyrodes '솔루션의 2L하려면 주식 I, II의 주식 80mL, 그리고 포도당의 4g의 80mL 거기에 탈이온수 및 믹스의 1840mL. </li><li> 염료 및 uncouplers의 재고 솔루션을 준비 (1) 여기 - 수축 uncoupler의 blebbistatin 주식 솔루션 (DMSO에 Tocris Bioscience, 2mg/mL 솔루션), (2) 전압에 민감한 염료 DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션 (Invitrogen, 1mg/mL DMSO의 용액) (3) 전압에 민감한 염료 RH 237 재고 솔루션 (Invitrogen, DMSO에 1.25mg/ml 솔루션) (4) 칼슘 표시기로드 - 오전 2시 재고 솔루션 (Invitrogen, DMSO에 1mg/ml 솔루션). 한 토끼 실험은 디 - 4 - ANEPPS 주식 솔루션 RH237 재고 솔루션을 30 μL 및로드 - 오전 2시 재고 솔루션을 200 μL의 약 30 μL가 필요합니다. 반복 동결 융해를 방지하기 위해, 우리는 -20 ° C.에 DI - 4 - ANEPPS 100 μL aliquots 저장 다른 염료는 -20 ° C.에 저장됩니다 4 ° C 냉장고에 녹아 blebbistatin를 저장합니다. </li><li> 이전 2L 병에 심장, 전송 Tyrodes '솔루션을 수확하고 37 솔루션 온도를 유지 물을 욕조 (피셔 과학) ° C.에 그것을 장소 5% CO 2 - 솔루션 95% O 2 산소입니다. 산도는 7.35에서 관리하고 있습니다 ± 0.05을 산소 수준을 조정하여. 솔루션은 Langendorff 재관류 시스템의 순환이며 나일론 그물 필터 (기공 크기 : 11μm, Millipore)에 의해 필터링되는 정맥 전에 재관류 라인에 배치. </li><li> 마음을 수확하기 전에 모니터링 장비를 준비합니다. 압력 변환기 (WPI)은 실험 동안 대동맥 압력을 모니터링하는 데 사용됩니다. 압력 변환기의 기준은 심장이 재관류 시스템으로 연결하지 않을 때 mmHg를 제로로 조정됩니다. 의사 - ECG 전극은 대략 리드 I, II, 및 Einthoven 삼각형 ECG의 III에 챔버에 배치됩니다. </li></ol> 2. 토끼 하트의 수확 및 재관류 <ol><li> 토끼 restrainer의 토끼를 수정. 나트륨 pentobarbital (50 MG / ㎏) 2000 U의 헤파린의 정맥 주사하여 토끼를 안락사. 토끼 고통 반사의 부족에 의해 결정되는, 완전히 euthanized되면​​ 흉강은 빠르게 개방되고 심장과 폐가 excised 수 있습니다. </li><li> 대동맥 아치의 모든 지점 전에 대동맥을 오름차순의 위쪽 끝에 상처를 확인합니다. 오름차순 대동맥에서 공기를 제거하고 신속하게 이전 coronaries의 공기를 밖으로 유지하는 것이 매우 중요합니다 버블 사냥꾼에 첨부되어 16 게이지 정맥에 마음을 cannulate. 심장이 retrogradely 아닌 순환 Langendorff 재관류 시스템에 perfused되면 상처가 빠르게 심장막를 엽니다합니다. </li><li> 혈액이 재관류에 의해 플러시하는 동안, 폐, 기관, 지방과 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 매우 중요하다! 실리콘 튜브는 (직경 3cm ~ 긴, 그리고 2mm) 좌심실 (LV)에 폐동맥 정맥과 승모판을 통해 삽입하여 실험을하는 동안 거기에 보관됩니다. 이 튜브는 LV에 갇혀있는 솔루션을 출시. 기계식 고정 마음에 Langedorff - 재관류 실험 기간 동안 시간 동안 순환이 없다면, 그것은 LV에 고인 심각한 국소 빈혈을 일으킬하고 부정맥을 생산 가능성이 높습니다. </li><li> 광학 매핑 장치로 재순환 Langendorff - 재관류 시스템에 정맥으로 마음을 이동합니다. </li></ol> 3. 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 실험을 실시 <ol><li> 사용자 정의 - 만든 육각 챔버에 마음을 놓고 살수 시스템에 정맥을 연결합니다. 재관류 펌프의 유량을 조정하여 60 대동맥 압력 ± 5 mmHg를 유지합니다. 나는 의사 - ECG를 이끌어 모니터링합니다. 주변에 산도 7.35 ± 0.05를 유지합니다. </li><li> blebbistatin는 스펙트럼의 보이는 부분의 자외선과 낮은 엔드 (450-490 nm의) 17에 의해 photoinactivated 때문에 방의 조명을 해제합니다. 천천히 정맥 위에있는 공기 거품 사냥꾼의 사출 포트를 통해 blebbistatin 재고 솔루션을 주입. 천천히 모든 bolus 주입에 대한 0.1ml blebbistatin를 삽입. 다음 주사하기 전에 안정화에 압력을 기다립니다. </li><li> 너의 기치를 실험 디자인에 특정 위치에 서성 거려 전극을 배치. </li><li> 거미의 각 사진 - 다이오드 배열의 이미지 비행기 (PDA)에있는 프로스트 유리의 중심부의 이미지를 초점골고루 마음을 주변 각도 간격. 세 PDA의 뷰 필드의 중심부에 맞게하기 위해 정맥 각 PDA와 심장 사이의 거리의 위치를​​ 조정합니다. 프로스트 유리의 각 초점을 맞춘 이미지의 사진을 가져가라. </li><li> 천천히 10을 삽입 ~ 재관류 솔루션에 공기 거품 트랩에 주입 포트를 통해 20μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션입니다. 광학 녹음을 복용하기 전에 1 ~ 3 분 동안 기다리십시오. </li><li> 첫 녹화, 녹색 LED 조명 (NO 여기 필터, LED 홍수, LUMILEDS)에 설정 사용자 정의 - 만든 데이터 수집 시스템과 관련된 세 PDA를 5에서 동시에 광학 녹음을하고 LED 조명을 끄십시오. 세 PDA의 다른 픽셀에서 신호의 품질을 확인합니다. 광학 작업 잠재력에 모션 아티팩트가 주목하는 경우 0.1 ~ 0.2mL blebbistatin 주식 솔루션을 추가합니다. 신호 대 잡음 비율이 낮으면 앞으로 5 μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션을 추가합니다. </li><li> 기능 연구에 대한 설계 실험 프로토콜을 마침. 신호가 photobleaching 또는 유실로 인해 실험 기간 동안 일이요 경우 추가 5μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션으로 마음을 다시 얼룩. </li><li> 기능 연구의 완료 후 객실 라이트를 켭니다. 36 균등하게 게재 각도에서 마음의 사진을 가져가라. 이것은 하나 PDA의 위치에 고정 디지털 카메라와 10 °의 단계에서 마음을 회전하여 이루어진다. </li><li> 챔버 밖으로 마음을 가져가라. 모든 솔루션을 드레인. DI 물, 70 % 시약 알코올, 다시 DI 물의 순서에 재관류 시스템을 씻으십시오. </li><li> 데이터 분석 36 디지털 사진, 복원된 도형의 표면에 광학 신호의 등록 및 행동 잠재력 기간 (APD)의 부량, 전도 속도 (CV), 위상 등 6 심장 기하학의 재건을 포함 </li></ol> 4. 듀얼 매핑 시스템을 사용하여 실험을 실시 <ol><li> (2 부 이후 계속)는 유리 챔버 (Radnoti)의 cannulated 마음을 놓고 살수 시스템에 정맥을 연결합니다. 심실과 심방 꼭대기에있는 챔버의 실리콘 하단에 마음을 아래로 핀. </li><li> 방 조명을 해제합니다. 천천히 마음을 고정하기 위해 재관류의 정맥하기 전에 사출 포트를 통해 (10μM에 도달하는 15 ~ 20 분) blebbistatin 재고 솔루션을 주입. </li><li> 솔루션 표면의 움직임을 줄이기 위해 epicardial 표면 위에 플라스틱 페트리 접시, 또는 다른 유리 창문 커버를 넣어. </li><li> 보기의 동일한 필드에 매핑 듀얼 시스템 (울티마 - L, SciMedia)에서 두 CMOS 카메라를 중점을두고 있습니다. 형광 방출은 이색성 거울 (635nm 컷오프, 오메가 광학)로 구분하고, 전압 신호 700nm longpass 필터 (Thorlabs)와 칼슘 신호 30분의 590 nm의 대역 통과 필터 (오메가 광학)에 의해 필터링됩니다. </li><li> 심지어 조명을 달성하기 위해보기의 필드 매핑을 향해, ​​2 할로겐 램프 (SciMedia, 코스타 메사, CA 뉴 포트 출창 인 스트 루먼트, 스트 랫 포드, CT)의 빛을 가이드를 목표로하고 있습니다. 여기 필터 (40분의 531 NM, SemRock)이 사용됩니다. </li><li> 사출 포트를 통해 전압에 민감한 염료 RH 237 재고 솔루션 (10 ~ 30 μL)로 마음을 얼룩. </li><li> Pluronic F - 127과 함께로드 - 오전 2시 (0.2mL) 재고 솔루션 (Invitrogen, 1시 1분 혼합)를 섞는다. 물 목욕 sonicator에서 1min에 대한 Sonicate. 거품 사냥꾼의 포트를 통해 혼합물을 주입. 로드 - 2의 드 에스테르화이 매핑 시작하기 전에 오전 수 있도록 약 20 분간 기다리십시오. </li><li> 한 기록은 솔루션의 표면에서 움직임을 피하기 위해 superfusion 펌프를 해제하고, 여기 광원 (할로겐 램프)를 설정하고, 데이터 수집 시스템 (울티마 - L, SciMedia)에 연결된 두 카메라를 사용하여 광학 녹음을 ; 여기 조명을 해제 및 superfusion 펌프를 켭니다. 광 신호의 품질을 확인합니다. 조직 필요한 경우를 다시 얼룩. </li><li> 연구 설계 실험 프로토콜의 나머지 부분을 완성. </li><li> 객실 불 켜고 볼 분야를 포함하는 심장의 사진 가져가라. 챔버 밖으로 마음을 가져가라. 모든 솔루션을 드레인. DI 물, 70 % 시약 알코올 (피셔 과학) 및 DI 물의 순서에 재관류 시스템을 씻으십시오. </li><li> 데이터 분석 APD, CV, 칼슘 과도 기간 (Ca​​TD), AP의 상승 운동 고양이의 상승, 과도 칼슘의 상승 시간 및 고양이 부패의 monoexponential 맞지의 지속 시간 사이의 지연 측정을 포함하고 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 Langendorff - perfused 토끼 실험의 대표 발생합니다. 3 차원 메쉬 - 격자 표면의 형태로 토끼 심장과 복원 토끼 심장 기하학의 (A) 앞쪽에 볼 수 있습니다. (B) T그는 epicardial 표면을 풀어 색상 코드 tachyarrhythmia의 에피소드 중에 빨간색으로 표시된 파면을 나타내는 위상 (위상 비행기 분석 18 획득)에 의해. (C) 안정 들어가는 부정맥의 사이클 동안 활성화 파면 (붉은 색) 전파 패널 B. (D) 여덟 스냅샷에서 1-5로 표시된 위상 특이점 주변 5 개 지역에서 광 실천 가능성 레코딩. 파면 서클은 심장의 앞쪽에 표면에서 볼 수있는 위상 특이점 주위를 시계 방향으로. repolarization의 색상 (파란색)은 사후 파면 (예, 80ms, 100ms, 120ms에서하고) 볼 수 있도록 부분적으로 투명하게 설정됩니다. 이 들어가는 부정맥의 영화는 보충 비디오 1로 제공됩니다. 지오메 트리 재건, 신호 등록, 위상지도의 계산, 그리고 표면 unwrapping위한 방법은 다른 여섯 자세히 설명되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 이중 매핑 시스템 (일시 액션 잠재력과 칼슘을 동시에 매핑)을 사용하여 Langendorff - perfused 토끼 심장 실험에서 대표 발생합니다. 검은 점들의 적용을보기의 매핑 필드와 함께 마음의 (A) 앞쪽에 표면. 하나의 사이트에서 레코딩 (B) 클로즈업 볼 수 있습니다. (C) 샘플 작업 가능성의 흔적 (파란색)과 칼슘 모든 픽셀 녹음이 표시 및 공간적 해상도가 200μm있다는 것을 패널 A. 참고에 검은 점들로 표시 균등하게 게재 위치의 배열에서 (적색) 과도.

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</ol>

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경험을 바탕으로 성공적인 Langendorff - perfused 토끼 심장의 실험을위한 열쇠는 잘 준비 Tyrodes &#39;솔루션의 중심 빠른 수확, 잘 유지 재관류의 압력과 재관류 시스템에서 산소 솔루션의 적절한 산도를 포함합니다. 최고의 신호 대 잡음 비율로 신호를 기록하기 위해, 우리는 광원, 광학 필터, 광학을 집중, photodetectors 등 19를 포함한 요소를 고려해야합니다. 이러한 측면의 세부 사항은 다른 19 설명합니다. 젊은 토끼는 (연령 : 4-5개월, 중량 : 7-9파운드) 광 신호의 잡음 비율로 신호를 감소 epicardial 지방을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. 각 픽셀에 의해 기록된 신호는 조직의 볼륨에서 방출되는 빛의 가중치 통합이다. 이 조직 량의 깊이에 사용되는 염료의 여기 및 발광 파장에 따라 달라집니다. DI - 4 - ANEPPS 들어, 예를 들어, 예상 침투 깊이는 토끼 심장 20 300μm이다. 따라서 광 신호의 해석은 전기 함수의 지역 이질이 sinoatrial 노드 방실 노드에 존재하는 경우주의 완료하고, 심실 부정맥 1,21,22 동안해야합니다. 전극 기록에 비해 광학 매핑 기법 중 하나 제한 광학 행동 잠재력의 repolarization 단계가 종종 심장 수축에 의한 움직임의 유물에 의해 distored 때문입니다. 기계 제약은 유물을 줄이기 위해 사용될 수 있지만, 완전히 제거 수 없습니다. 비교에서, 약리 여기 - 수축 uncouplers는 모션 유물을 제거에 효과적입니다. 그러나 이러한 uncouplers (예 : 2,3 - Butanedione Monoxime) 상당한 electrophysiological 부작용이 없습니다. Blebbistatin은 정상적인 심장 23 심장 전기 생리학에 아무런 부정적인 부작용이 없다하는 시연하고, 따라서 광학 매핑을위한 유망한 uncoupler가되었습니다. 그것은 수축의 폐지로 인한 부종의 가속 또한 전기 생리학에 영향을 미칠 수 있다고 지적한다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S271 - 1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2 시간 2 O) </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> C79 - 500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S217 - 500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S369 - 500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S233 - 3 </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> D16 - 1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> DI - 4 - ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> 로드 - 오전 2시 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> 디메틸 sulphoxide (DMSO) </td><td> 시그마, 세인트 루이스, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

langendorff - perfused 토끼 하트의 multiparametric 광 매핑

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

광학 이미징 및 형광 프로브는 다른 접근법 1 성취되지 않았을 수도 방법으로 심장 전기 생리학 분야에서 상당히 고급 연구 방법론 있습니다. 칼슘 및 전압에 민감한 염료를 사용하여, 광학 매핑은 조직과 물리적 접촉없이 높은 공간 해상도를 가진 transmembrane 액션 잠재력과 칼슘 과도 측정 수 있습니다. 이것은 전극의 사용이 불편 또는 1 불가능합니다 많은 조건에서 심장 전기 활동을 측정 할 수 있습니다. 종래의 전극 기술은 전극 분극 1 인한 자극하는 동안 및 이후 자극 유발 유물에서 고통 중에 예를 들어, 광학 녹음은 자극과 defibrillation 동안과 직후 막 잠재력을 정확하게 형태학의 변경 사항을 제공합니다. Langendorff - perfused 토끼 심장은 인간의 심장 생리학과 pathophysiology의 가장 연구 모델 중 하나입니다. 임상 관찰 arrhythmias의 많은 종류의 토끼 심장 모델 recapitulated 수 있습니다. 이것은 마음과 재입국의 파장의 효율적인 크기에 의해 결정 심실 arrhythmias 동안 토끼 심장에 웨이브 패턴이, 사람의 마음 2에서 매우 유사 표시되었다. 그것은 또한 sarcoplasmic reticulum (SR)의 상대적인 기여로, 토끼 myocardium의 결합 여기 - 수축의 중요한 측면 (EC)는 인간 EC 커플링 3 매우 유사 것으로 나타났습되었다. 여기 Langendorff 재관류 시스템 설정, 광학 매핑 시스템 설치, 심장, 재관류 및 심장, 여기 - 수축의 염료 염색법의 고립과 cannulation 포함한 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험의 기본 절차를 제시 uncoupling, 광학 신호를 수집. 이러한 방법은 또한 유량 조정, 광학, 솔루션 등 토끼가 아닌 다른 종의 심장에 적용 될 수 두 광학 매핑 시스템이 설명되어 있습니다. 파노라마 매핑 시스템은 4-7 토끼 심장의 전체 epicardium를 매핑하는 데 사용됩니다. 이 시스템은 arrhythmogenesis 및 defibrillation 중에 들어가는 회로의 진화 글로벌 전망을 제공하고 arrhythmias 및 antiarrhythmia 치료 8,9의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 이중 매핑 시스템을 볼 수 10-13의 동일한 분야에서 동시에 (CAT) 과도 작업 잠재력 (AP)와 칼슘을지도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 전기 alternans 및 부정맥 14-16의 유도에 칼슘의 중요한 역할에 대한 우리의 이해를 강화하고 있습니다.

이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

광학 이미징과 형광 프로브는 기존에는 불가능했던 방식으로 심장 전기생리학 분야의 연구 방법론을 크게 발전시켰습니다.

본 실험 절차의 전반적인 목적은 랑고(langor) 방식으로 관류된 토끼 심장에서 광학 매핑 기술을 사용하여 전도, 재분극, 부정맥 유발 및 칼슘 처리와 같은 심장 전기생리학적 특성을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 온전한 토끼 심장을 적출하여 대동맥을 통해 역행성으로 관류합니다. 그다음 단계로 심장 표면을 노출시키고, excitation contraction on Coler BLEs statin을 사용하여 심장 수축을 정지시킨 후, 전압 민감성 및 칼슘 형광 지시약을 사용하여 심근을 적절히 염색합니다.그런 다음 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 심실 심외막의 상당 부분에서 광학 활동 전위 기록을 수행합니다. 이후 광학 신호를 재구성된 심장 심외막 표면의 3D 기하학적 구조에 매핑합니다. 이 단계에서 비파노라마 듀얼 이미징 시스템을 사용하여 광학 활동 전위와 칼슘 과도 현상을 동시에 기록할 수 있습니다.본 절차는 규칙적인 리듬뿐만 아니라 심방 및 심실 부정맥 동안 분석 가능한 심근의 공간적 및 시간적 흥분과 재분극, 그리고 칼슘 핸들링의 일치하는 특성에 대한 정량적 데이터를 제공합니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 워싱턴 대학교의 의생명공학 교수인 Iger Eov 박사입니다.오늘 저희가 소개할 광학 기술은 기존의 마이크로 전극 및 마이크로 전기도표법(electrograms)에 비해 여러 가지 장점을 가진 독보적인 기술로, 수십, 수만 개의 활동 전위와 칼슘 과도 현상(calcium transients)을 동시에 기록할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 모든 전기도표법으로 기록되는 활동 전위를 심하게 왜곡시키는 전기 자극 및 제세동으로 인한 아티팩트(artifacts)의 영향을 받지 않습니다. 더불어, 칼슘 과도 현상은 오직 이 기술을 통해서만 기록될 수 있습니다.다른 대안이 없습니다. 이 방법은 치명적인 심방 및 심실 부정맥의 유도, 유지 및 종료 기전뿐만 아니라 선천성 심장 질환, 대사 질환 및 심부전과 같은 질병에서의 전도 및 흥분-수축 결합의 기능 모델링과 같이 심장 전기생리학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수술 준비가 완료되면 소듐 펜토바르비탈과 헤파린 혼합액으로 토끼를 안락사시킵니다.토끼가 통증 반사에 반응하지 않는 즉시, 흉부를 열고 심장과 폐를 적출합니다. 대동맥궁의 모든 분지 전 상행 대동맥의 상단부를 절개한 후, 비재순환 LRF 관류 시스템의 펌프를 가동하여 Tyro 용액이 흐르도록 합니다. 심장을 LOR 관류 시스템과 연결된 16게이지 대동맥 캐뉼라에 빠르게 장착합니다.대동맥 내의 공기를 모두 밀어내고, 관류가 완전히 이루어지면 대동맥 캐뉼라를 결찰합니다. 지체 없이 심낭을 절개하십시오. 그 후 심장을 둘러싸고 있는 폐 기관지 지방과 결합 조직을 제거합니다.허혈을 유발할 수 있는 좌심실 내의 액체 축적을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 따라서 실리콘 배액관을 폐정맥과 이첨판을 통해 좌심실로 삽입하십시오. 이제 캐뉼라가 연결된 심장을 광학 매핑 시스템이 장착된 재순환 Langendorf 관류 시스템으로 이동시키십시오.심장을 맞춤 제작된 육각 챔버에 넣고 캐뉼라를 관류 시스템에 연결합니다. 압력 트랜스듀서를 사용하여 대동맥압을 모니터링하며, 관류 펌프의 유량을 조절하여 압력을 60 ± 5 mmHg로 유지합니다. pH는 7.35 ± 0.05 정도로 유지합니다.실내 조명을 끄고 캐뉼라 상단에 위치한 기포 제거기의 주입구를 통해 빛에 민감한 BLEs statin 스톡 용액을 천천히 주입합니다. 10 µM의 BLEs statin 농도에 도달하려면 0.1 mL의 BLEs statin을 천천히 주입하십시오. 매회 볼러스 주입 시, 다음 주입 전 압력이 안정될 때까지 기다립니다.포토다이오드 어레이(PDA)를 심장 주변으로 3등분 된 각도에 배치합니다. 그런 다음 각 PDA에서 심장의 이미지가 이미지 평면의 프로스티드 글라스(frosted glass)에 초점이 맞도록 조절합니다. 심장이 세 개의 PDA 모든 시야에 들어올 때까지 육각형 챔버 내 캐뉼라의 위치와 각 PDA의 위치를 조정합니다.그 후, 무광 유리에 투영된 각 초점 이미지의 사진을 찍습니다. 공기 방울 트랩의 주입구를 통해 D four Anep 스톡 용액 10 to 20 µL를 관류액에 천천히 주입합니다. 그리고 3분 동안 기다립니다.다음으로, 페이싱 전극을 원하는 위치에 조심스럽게 배치합니다. 여기서는 심장의 전면부 중앙에 배치하였습니다. PDA로부터 광학 기록을 동시에 시작합니다.광학 신호에 움직임으로 인한 아티팩트가 없으며, 후속 데이터 분석을 위해 신호 대 잡음비가 충분한지 확인하십시오. 완료되면 실내 조명을 켜고, PDA 중 하나의 위치에 설치된 카메라를 사용하여 10도 회전할 때마다 사진을 한 장씩 촬영하여 심장의 사진 기록을 남기십시오. 그런 다음 관류 시스템의 세척을 진행하십시오.캐뉼라가 삽입된 심장을 라운드 글라스 챔버에 넣고 캐뉼라를 관류 시스템에 연결합니다. 심장의 심실 첨부와 심방 부위를 핀으로 고정하여 챔버의 실리콘 바닥에 고정합니다. 심장을 부동화하기 위해 실내 조명을 끄고, 용액 표면의 움직임을 줄이기 위해 주입구를 통해 BLEs statin을 천천히 주입합니다.심외막 표면 위에 유리 윈도우 커버를 놓습니다. 이 절차 단계는 보통 암실에서 수행되지만, 여기서는 밝은 곳에서 진행하고 있습니다. 비디오 영상을 개선하기 위해 이중 이미징 시스템을 심장 위로 이동시킵니다.이제 두 CMO 카메라의 초점을 동일한 시야에 맞춥니다. 다음으로 여기 필터가 장착된 두 개의 할로겐 램프 광가이드를 배치합니다. 주입구를 통해 10 to 20 µL의 전압 민감성 염료 RH 2 37을 첨가하여 심장을 염색합니다.그런 다음 버블 트랩 포트를 통해 1:1 혼합 비율의 road 2:00 AM과 onic F1 27 200 µL를 추가합니다. 매핑을 시작하기 전, road 2:00 AM의 DS ification이 이루어질 수 있도록 약 20분 동안 대기합니다. 이제 테스트 녹화를 수행합니다.용액 표면의 움직임을 방지하기 위해 슈퍼퓨전 펌프를 끕니다. 할로겐 램프를 켜고 양쪽 카메라에서 광학 기록을 수행합니다. 그런 다음 여기광을 끕니다.초과관류 펌프(superfusion pump)를 켜고 광학 신호의 품질을 확인하십시오. 신호가 약한 경우, RH 2 37 및 road 2:00 AM을 추가하여 심장을 다시 염색하십시오. 모션 아티팩트(motion artifact)가 발생하는 경우, BLEs statin을 추가로 투여하여 움직임을 제거하고 모든 상태가 정상인지 확인하십시오. 계획된 실험을 진행하고 시스템을 정리하십시오.작업이 완료된 후, 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 Lang Endorf 방식으로 관류된 토끼 심장의 전면도를 나타냈습니다. 이와 비교하여, 심장 기하학적 구조의 재구성 모델은 동일한 전면도를 보여줍니다. 여기에 표시된 펼쳐진 심외막 표면은 위상별로 색상 코딩되었습니다.심장은 로터 주변의 5개 위치에서 빈맥성 부정맥(tachy arrhythmia) 삽화를 겪고 있었습니다. 광학 활동 전위가 제시되었습니다. 여기 빨간색으로 표시된 것은 안정적인 재진입 부정맥(reentrant arrhythmia) 주기 동안 전파되는 활성화 파면입니다.파면이 심장의 전면 표면에 있는 위상 특이점(phase singularity)을 중심으로 시계 방향으로 회전합니다. 심장 후면 표면의 파면을 시각화하기 위해 재분극은 투명한 파란색으로 표시되었습니다. 심장은 활동 전위와 칼슘 과도 현상의 동시 매핑을 보여주기 위해 이중 매핑 시스템을 사용하여 분석되었습니다.단일 지점의 기록을 근접 촬영한 모습으로, 파란색은 활동 전위를, 빨간색은 칼슘 과도 현상을 나타냅니다. 이 전면도에 표시된 점들과 같이 일정 간격으로 배치된 지점들에서 수집한 샘플 트레이스 배열이 표시되어 있습니다. 이 데이터는 픽셀당 200 microns by 200 microns의 광학 해상도로 수집되었습니다.전기치료 중에 강한 전기 자극의 효과를 직접 시각화할 수 있으므로, 이 치료법의 영향은 심방 및 심실의 10 K 부정맥에 대한 제세동 치료로 확대됩니다. 이를 수행할 수 있는 다른 대체 방법은 없습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 심방세동 및 심실빈맥을 위한 새로운 저전압 무통증 제세동 치료법을 개발하고 검증했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

이 보고서는 방법론과 스트레치 유발 심방 세동 동안 Langendorff - perfused 양의 마음을 그대로 좌심방의 전기적 자극을 동시에 endocardial와 epicardial 광학 매핑의 결과에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

스트레치 유도 심방세동 세동의 쉽 모델에서 고해상도 Endocardial 및 Epicardial 광학 매핑

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

이 비디오에서는 고립된 쥐 심장의 Langendorff 역행 관류를 수행합니다. 시술 중, 상행 대동맥에 삽입된 캐뉼라를 사용하여 관상 동맥을 통해 관류 용액으로 역행하여 심장의 심장 활동을 유지합니다. 이 모델은 심장의 심장 병리 생리학을 연구하는 데 사용됩니다.

Langendorff 역행성 심장 관류: 고립된 쥐 심장을 관류하는 생체 외 기술

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

여기에, 우리는 높은 공간 및 시간 해상도, 마우스 우심방 특히 중국 - 심방 노드에서 전기 활동의 광학 매핑을위한 프로토콜을 제시한다.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

여기에서 우리는 심혼에 있는 심실 광학 카테터를 심장 벽을 가로질러 흡광도 분광학을 능력을 발휘하기 위하여 공류된 심혼에 이용하는 방법을 소개합니다. 얻은 데이터는 조직 산소 장력뿐만 아니라 기질 활용 및 멤브레인 잠재력에 대한 강력한 정보를 이 유비쿼터스 제제에서 심장 성능 측정과 동시에 제공합니다.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

배우세요 Langendorff 관류 토끼 심장에서 다중 광학 매핑 기술을 활용한 심장 전기생리학 연구 방법을. 이 기법은 심실 재분극 및 칼슘 처리 메커니즘을 정량적으로 분석하여 부정맥 발생 원인을 규명하는 데 활용됩니다.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

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