관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

이 데모의 전반적인 목표는 분산 또는 이동 연구를 위해 곤충에 단백질을 표시하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 데모에는 샌드위치 또는 간접 효소 결합 면역 흡착 분석법으로 표시를 감지하는 방법에 대한 방법이 포함되어 있습니다. 이 방법은 곤충 분산 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

곤충 이동 패턴, 곤충 숙주 식물 선호도 및 침입 종의 확산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 감지 방법이 간단하고 저렴하다는 것입니다. 높은 처리량에 적합하며 동물은 자연 서식지에서 쉽게 직접 표시할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 대부분의 현장 연구자들이 이 간단한 기술에 대한 경험이 없기 때문에 실제보다 더 어려워 보이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 1989 년에 처음 떠올랐습니다. 우리는 인공 사료로 큰 눈을 가진 포식자를 키우고 있었습니다.

우리는 이 벌레들이 부자연스러운 식단으로 오랫동안 사육된 후 Lygus 벌레 해충에 효과적인 포식자가 되지 않을 것을 우려했습니다. 다른 말로 하면, 그들은 길들여질 것입니다. 우리는 밭에 방류된 후 원래 품종과 구별할 수 있는 안전하고 효과적이며 저렴한 방법이 필요했습니다.

현재 마킹 방법 중 어느 것도 이러한 기준에 부합하지 않습니다. 이전에 ELISA 절차를 사용하여 Lygus 특정 단백질 잔해에 대한 포식자 내장 함량 분석을 수행한 경험을 통해 실험실에서 사육된 포식자에 외부 단백질 표시를 적용해야겠다는 아이디어를 얻었습니다. 차례로, 우리는 Lygus 유해와 외래 단백질 유골에 대해 수집된 밭에서 큰눈박이벌레를 분석할 수 있었습니다.

시작하려면 실험실 식민지 또는 현장에서 관심 곤충 약 100마리를 수집하고 두 개의 깨끗한 사육 용기로 나눕니다. 한 용기에 일반 20ml 다이어트 패킷을 넣어 음성 대조군 역할을 합니다. 다른 방법은 다이어트 팩에 닭고기 IgG-IgY 밀리그램을 묶

용액 1ml를 넣고 잘 섞습니다. 필요한 경우 패킷 대신 곤충이 일반적으로 먹이는 것을 사용하십시오. 이 다이어트 패킷으로 사육된 지 24시간이 지나면 두 그룹의 곤충 모두에게 표시가 없는 정상적인 음식을 공급하십시오.

원하는 시간 간격으로 각 코호트에서 20마리의 개별 곤충을 수집합니다. 실험에 필요한 모든 코호트가 수집될 때까지 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. ELISA를 위한 96웰 플레이트를 준비하기 위해 각 웰에 500분의 1로 희석된 토끼 항닭 IgY 1차 항체 50마이크로리터를 Tris-Buffered Saline 또는 TBS에 추가합니다.

적재된 플레이트를 실온에서 최소 한 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 나중에 우물을 비우고 각 우물에 300마이크로리터의 블록 용액을 추가합니다. 이것은 1% 무지방 분유 용액입니다.

플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 블록 배양 중에 개별 냉동 곤충을 1ml의 TBS가 적재된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 깨끗한 유봉으로 각 곤충을 철저히 균질화하십시오.

플레이트가 준비되면 각 웰에 100마이크로리터의 균질화된 곤충 샘플 하나를 로드합니다. 각 96웰 플레이트에는 80개의 시편이 수용됩니다. 컨트롤을 위해 플레이트의 첫 번째 열과 마지막 열을 비워 두십시오.

첫 번째 열에서 TBS의 100마이크로리터 부분 표본 7개를 단독으로 로드하고 난백자 양성 대조군이 있는 100마이크로리터의 TBS를 1웰에 로드합니다. 마지막 열에서 8개의 표시되지 않은 곤충 제제 100마이크로리터를 로드합니다. 샘플을 실온에서 최소 한 시간 동안 배양합니다.

배양 후 Phosphate Buffered Saline Tween 또는 PBS-Tween으로 웰을 조심스럽게 세 번 세척합니다. 우리의 경험을 통해 우리는 대부분의 오류가 세척 단계에서 발생한다는 것을 배웠습니다. 튀는 것은 위양성 반응의 높은 발생으로 이어질 수 있으므로 주의하십시오.

세척 후에, 양고추냉이 peroxidase에 활용된 토끼 반대로 닭 IgG-IgY의 50 마이크로리터를 추가하고, 10에 묽게 한 것, 1% 우유 해결책에서 000를 추가하십시오. 용액이 실온에서 최소 1시간 동안 웰에서 배양되도록 합니다. 나중에 이전과 같이 PBS-Tween으로 플레이트를 세 번 씻어냅니다.

그런 다음 웰에 50마이크로리터의 TMB 기질을 로드합니다. 즉시 색상이 변하기 시작할 수 있습니다. 플레이트를 10분 동안 배양한 후 마이크로플레이트 분광 광도계로 판독합니다.

650나노미터에서 플레이트를 읽고 값을 기록합니다. 곤충을 외부에 표시하려면 접근 구멍이 있는 1리터 플라스틱 병을 준비하고 곤충 100마리를 두 병으로 나눕니다. 그런 다음 한 용기에 곤충에게 1ml의 증류수를 뿌려 네거티브 컨트롤 역할을 합니다.

그런 다음 의료용 분무기를 공기 배출구에 부착하고 분무기가 증기를 생성하도록 공기 흐름을 조정합니다. 다른 곤충에게 5% 닭 달걀 흰자 용액 1ml를 뿌립니다. 분무 과정을 완료하는 데 2분에서 5분 정도 걸립니다.

그런 다음 구멍을 코르크 마개로 막고 용액을 실온에서 완전히 건조시킵니다. 건조되면 곤충을 표준 식단과 함께 일반 사육 용기로 다시 옮기고 평소와 같이 유지하십시오. 나중에 테스트를 위해 미리 결정된 시간 간격으로 곤충을 수집합니다.

외부 마크 유지를 확인하려면 ELISA 분석과 동일한 절차를 사용하여 내부 마크 유지를 테스트하되 약간의 수정을 가합니다. 곤충을 TBS가 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 균질화하는 대신 120RPM의 궤도 셰이커에 한 시간 동안 담가둡니다. 곤충을 담근 후 용액 100마이크로리터를 플레이트 웰에 피펫으로 넣고 플레이트를 최소 한 시간 동안 배양합니다.

곤충 샘플을 씻어낸 후 각 웰에 1% BSA가 포함된 PBS 300마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 30분 후 PBS-Tween으로 웰을 두 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 PBS-BSA 실루엣에서 8,000분의 1로 희석된 토끼 항난자 알부민 1차 항체 50마이크로리터를 추가합니다.

적어도 한 시간 동안 플레이트를 배양하고 이전과 같이 우물을 씻어냅니다. 그런 다음 각 웰에 양고추냉이 과산화효소에 접합된 염소 항토끼 IgG 50마이크로리터를 첨가하고 PBS-BSA 실루엣으로 2,000분의 1을 희석합니다. 플레이트를 실온에서 최소 한 시간 동안 배양한 다음 앞에서 설명한 대로 프로토콜을 진행합니다.

내부 마크의 유지는 4개의 시점에서 테스트되었습니다. 전반적으로, 단백질 없이 처리한 곤충은 일관되게 낮은 ELISA 값을 산출했습니다. 반면, 단백질이 풍부한 식단을 먹인 모든 곤충은 일관되게 강력한 ELISA 값을 산출했습니다.

외부 마크도 4개의 시점에서 테스트되었습니다. 달걀 흰자로 국소적으로 표시된 곤충은 일관되게 강력한 값을 산출했습니다. 예상대로, 물을 뿌린 네거티브 대조군은 매우 낮은 ELISA 값을 기록했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 곤충을 표시하는 방법을 잘 이해하고 곤충의 흔적이 있는지 분석해야 합니다. 이 기술을 한 번 익히면 제대로 수행한다면 4시간 30분 안에 끝낼 수 있습니다. 하루 동안 1,000개가 훨씬 넘는 검체가 있는 16개의 분석 플레이트를 처리할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 분석이 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 모든 표면, 용기 및 장비에 단백질 오염이 없어야 합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 농업, 도시, 숲 및 기타 자연 서식지에서 곤충의 지역 및 지역 전체 분산 패턴을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

우리는 여기에서 소규모의 예를 보여주었지만, 이 기술은 상업용 스프레이 장비를 사용하여 자연 서식지에서 곤충에 직접 태그를 붙이기 위해 훨씬 더 큰 규모로 사용되었습니다. 우리는 공동 작업자의 창의적인 응용 프로그램에 놀랐습니다.