번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

이 절차의 전반적인 목표는 면역 검출 또는 PCR 분석에 적합한 초파리의 번데기 날개를 빠르고 효율적으로 해부하는 방법입니다. 여기에 설명된 절차는 PCR 분석 또는 면역검출 프로토콜을 수행하는 데 적합한 번데기 날개 샘플을 얻기 위한 빠르고 효율적인 방법을 찾기 위한 요구에 의해 개발되었습니다. 젖은 붓을 사용하여 배양 바이알에서 zero-hour APF 번데기를 부드럽게 제거하고 새 바이알에 넣어 개발 기간을 완료합니다.

예를 들어, 24시간 APF인 번데기를 사용하는 경우 바이알에 22시간만 남아 있습니다. 22시간이 되면 양면 테이프가 부착된 번데기를 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 이 전이는 번데기가 손상되지 않도록 붓을 사용하여 수행할 수 있습니다.

번데기는 등쪽이 위로 향하고 두부 끝이 같은 방향을 향하도록 줄을 형성하여 위치해야 합니다. 그런 다음 현미경 슬라이드를 일정한 온도로 되돌리고 번데기가 적절한 발달 시간을 완료할 수 있도록 합니다. 이 경우 24시간이 됩니다.

양면 테이프가 있는 현미경 슬라이드는 번데기 케이스를 제거하기 위한 임시 해부 플랫폼이 될 것입니다. 현미경 슬라이드에서 2시간 동안 번데기 케이스가 건조되어 집게로 쉽게 깨질 수 있습니다. 해부의 첫 번째 단계는 사체에서 번데기를 제거하는 것입니다.

그런 다음 번데기는 양면 테이프가 부착된 다른 슬라이드로 옮겨집니다. 시체는 남겨질 것입니다. 이 번데기는 복부 쪽이 위를 향하도록 테이프 중앙에 놓입니다.

날개 절단을 수행하기 전에 번데기는 면역 조직 화학을 사용한 절차에 따라 용액으로 덮어야합니다. 이 용액은 부착 적이며 날개가 표피에서 자유로워집니다. 집게를 사용하여 번데기에서 수술을 부드럽게 제거합니다.

집게로 케이스를 부수고 번데기 측면을 따라 번데기의 꼬리 끝까지 선을 만듭니다. 적절한 조명을 사용하면 번데기의 내부 모양을 시각화하여 번데기 날개의 경첩 바로 위에 분명한 공간을 만들 수 있습니다. 이 공간은 번데기를 손상시키지 않고 개구를 수행할 수 있는 안내 역할을 합니다.

케이스가 측면으로 열리면 일부를 제거하고 열린 테두리로 집어 들고 양면 테이프가 고정할 반대쪽으로 운반할 수 있습니다. 해부가 끝나면 번데기는 거의 벌거벗게 됩니다. 케이스 조각만 뒤쪽 끝을 덮고 있습니다.

집게를 사용하여 케이스의 나머지 부분을 부드럽게 누릅니다. 이 움직임은 번데기의 내부 끝을 들어 올려 머리와 흉부가 다음 단계에 붙어있을 수 있도록 우선 위치를 유지할 수 있습니다. 양면 테이프가 있는 새 슬라이드를 번데기에 뒤집습니다.

그런 다음 번데기가 테이프에 달라붙도록 살짝 누르고 슬라이드를 부드럽게 밀어 나머지 케이스에서 번데기를 제거합니다. 현미경 슬라이드를 뒤집습니다. 번데기는 머리나 흉부 부위 높이에서 등쪽에 붙어 있습니다.

면역조직화학을 사용하려면 벌거벗은 번데기 전체를 4%파라포름알데히드로 덮습니다. 10 분 후 가위를 사용하여 날개의 경첩 부분 또는 그 근처를 약간 절개하십시오. 부착사가 날개 상피에 도달하도록 합니다.

그런 다음 5분 후에 큐티클 경계에서 집게로 찢어 구멍을 확장하고 큐티클 주머니에서 날개 상피를 방출할 수 있습니다. 날개 조직이 해제되면 고정 30분이 완료될 때까지 파라포름알데히드 용액에 그대로 두십시오. 이 비디오에 설명된 해부 방법은 다양한 유형의 기술을 위해 다양한 개발 단계에서 Drosophila 번데기 날개의 고품질 샘플을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 한 마리의 번데기 또는 여러 번데기를 동시에 해부하기 위해 수행될 수 있습니다. 이것은 절차를 가속화하는 데 도움이 되어 절개된 많은 수의 날개에 더 쉽게 도달할 수 있습니다. 열린 케이스에서 벌거벗은 번데기를 꺼내려면 뒤쪽 끝이 충분히 작아야 합니다.

4 개 또는 5 개의 벌거 벗은 번데기를 동시에 제거하는 것은 가능하지만, 단일 양면 테이프를 사용하여 연속적인 단계에서 케이스에 부착 된 나머지 사람들을 제거 할 수있는 관련 지점은 아닙니다. 이것은 24-30시간 APF 날개의 컨포칼 이미지입니다. 염색은 패치된 단백질, 고슴도치의 표준 수용체, 핵 및 액틴 필라멘트의 발현을 보여줍니다.

mRNA를 분리하기 위해 더 큰 날개 샘플을 얻기 위해 유사한 해부 과정을 사용할 수 있습니다. 이 mRNA는 PCR 반응에 사용할 수 있는 cDNA를 합성하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 patched 및 actin의 발현을 감지하기 위해 얻은 제품을 보여줍니다.

이 프로토콜은 날개의 친숙한 형태를 유지하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다. 이러한 제제로부터, 날개의 분화 동안 단백질의 분포 및/또는 농축을 조사하기 위해 2D 또는 3D 이미지로 투사될 수 있는 이미지 스택을 얻을 수 있습니다. 유사한 프로토콜을 사용하여 PCR 반응에 필수적인 분자인 cDNA를 합성하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플을 수집할 수 있습니다.

이 절차는 번데기 날개 해부를 위해 이미 발표된 방법에 대한 대안적이고 보완적인 접근 방식을 제공합니다.