Name: 번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 배우세요 Drosophila 번데기 날개를 신속하게 분리하는 방법으로, 면역검출 및 PCR 분석에 적합한 샘플을 얻어 전사체와 단백질 발현 연구를 효율적으로 수행할 수 있습니다.

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우리는 CSIC confocal 현미경 검사 법;와 그녀의 기술 지원에 대 한 마리 디 Doménico를이 프로젝트에 주어진 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 그의 원고 교정;에 대 한 호세 레오나르도 Báez를 루치아노 코레아 비디오;의 창조에 그의 헌신을 비디오에 대 한 그녀의 목소리와 블루밍턴 초파리 재고 센터 제공 하는이 연구에 사용 하는 주식에 대 한 대출에 대 한 나탈리 아 Rosano 하. 이사벨 게레로 의해 단일 클로 널 항-Ptc 개발 Apa1에서는 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)는 NICHD의 후원을 얻은 고 아이오와의 대학, 생물학 학과, 52242 아이오와 시, IA에 의해 유지.

주 1
1. 수집 및 경작 번데기입니다.
<ol>
	<li>Puparium 대형 (APF) 또는 교양된 튜브에서 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 prepupae 후 0 h를 제거 하 고 거의 완전 한 개발 기간에 새로운 튜브에 넣어 (2.1 및 2.2 참조). 
	참고: 파리의 건강 한 인구 표준 자란 프로토콜을 사용 하 여 유지 되어야 합니다. 3 또는 4 일 후 달걀 누워 있다, 성인 개인의 최적의 개발 있도록 튜브에서 제거할 수 있습니다. 그들은 세 번째 탈피 애벌레 pupation 시작 될 때까지 일정 한 온도에서 유지 관리 됩니다. 애벌레/번데기 전환 0 h APF를 간주 하는 prepupa의 형성에 의해 표시 됩니다. prepupa 앞쪽 spiracles 튀어나온 모양 둥근 된 직사각형을 움직이지 흰 애벌레입니다.</li>
</ol>
주 2
2입니다. 양도, 해 부 및 고정입니다.
<ol>
	<li>칠하기 붓에 번데기 (2 h 개발 시간이 되기 전에 완료) 전송 더블 양면 테이프와 현미경 슬라이드를 준수. 등 쪽 측 및 두 부와 행 끝 같은 방향으로 향하게 하는 형태로 pupae를 놓습니다.</li>
	<li>일정 한 온도를 현미경 슬라이드를 반환 하 고 (즉, 24-30 h APF) 적절 한 개발 시간을 완료 하는 데 번데기를 허용. 
	참고: 이중 양면 테이프와 현미경 슬라이드 번데기 케이스 (아래 참조)를 제거 하는 일시적인 절 개 플랫폼 될 것입니다. (유리병) 밖에 서 현미경 슬라이드에 시간 경과 집게와 쉽게 깨뜨릴 만들기 번데기 경우 건조에 도움이 됩니다.</li>
	<li>operculum 집게를 사용 하 여 번데기 케이스에서 제거 합니다.</li>
	<li>(비디오에서와 같이) 집게 경우 휴식 그것의 꼬리 끝에는 번데기의 측면을 따라 라인을 만들기. 적절 한 조명 분명 번데기 날개의 바로 위에 경첩 공간 만들기 번데기의 내부 형태를 검출 하기 위하여 가능 하다. 이 공간 번데기를 손상 없이 여 수행 하는 가이드 역할을 합니다.</li>
	<li>케이스, 열린된 국경에 의해 그들을 데리 고 이중 면 테이프 그들을 막을 것 이다 반대 측에 그들의 부분을 제거 합니다. 해 부의 끝에 번데기는 거의 "누드", 케이스의 단지 작은 조각을 후부 팁을 덮고 있을 것 이다 있을 것 이다. 참고: 위 꼬리 끝에는 작은 양의 경우의 목적은 이중 양면 테이프와 함께 슬라이드에 사건에서 부드러운 릴리스 되도록. 이 작업 뒤에 이유는 때문에 너무 많이 제거 하면 경우의 수는 크게 번데기 손상 위험. 다른 한편으로 너무 작고, 제거 하면 번데기 쉽게 오지 않을 경우 무료.</li>
	<li>아래로 밀어 (겸 자)와 케이스의 나머지. 이 운동은 머리와 흉부 준수 하 고 다음 단계에서 전송 우선 위치에 번데기의 앞쪽 끝을 올릴 것 이다.</li>
	<li>더블 양면 테이프와 새 슬라이드 하 고 번데기 또는 pupae 행에 반전. 번데기의 파손을 방지 하기 위해 stereomicroscope의 도움으로 움직임을 관찰 하 여이 방법을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>약간 pupae 테이프에 충실 하 고 부드럽게 슬라이드의 경우 나머지에서 번데기를 제거 하려면 활강을 누릅니다. 현미경 슬라이드 반전: 번데기 수준 그들의 머리의 등 쪽에 붙어 있을 것입니다 / 가슴 지역.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde 모든 벌 거 벗은 pupae를 커버 하 고 10 분을 기다립니다. 우리의 경험에는 정착 제와 시간이 경과 표 피 회사, 덜 끈 적 하 고 취급 하 게 쉬운 그것을 만들기의 일관성을 변경 수 있습니다. 
	참고: Ribonucleic 산 (RNA) 추출을 수행 하려면 RNase와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 대 한 대체 paraformaldehyde 물 무료 하 고 만드는 각 돌출부의 힌지 지점 근처 (가 위 만으로도) 컷 번데기 날개를 제거 합니다. Guanidinium 안산 및 페 놀 시 약의 1 mL microcentrifuge 튜브에 번데기 날개를 전송 집게를 사용 하 여. 50-80 날개의 총 수집 후 RNA 추출10,11수행까지-80 ° C에서 microcentrifuge 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>작은 절 개를 경첩 지역에서 날개의 또는 근처를 확인 합니다. 정착 액 날개 상피에 도달 하실 수 있습니다. 날개에는 피 펫 (p200) 플러시 통을 사용 하 여. 홍 조 대체 하는 경우는 오염 된 흥분 시키는 새로운. 홍 조, 후 5 분 동안 정착 액에 날개를 유지. 
	참고: 이 책략 오염 직물의 대다수를 멀리 맑게 하는 데 도움이, 비록 일부 hemocytes와 지방 방울 남아 있을 수 있다 날개의 등 쪽과 복 부 상피 층 사이 덫 ( 그림 1A참조).</li>
	<li>(비디오에서와 같이) 표 피 테두리에서 집게로 눈물 구멍을 확대 하 고 표 피 sac에서 날개 상피의 릴리스를 사용. 일단 날개 조직 발표, 고정 30 분 완료 paraformaldehyde 솔루션에 둡니다.</li>
	<li>것을 PBST 4 던 플라스틱 접시 가득 고정된 날개를 전송 (Triton X-100 0.05%). 4 ° c.에 게 하룻밤</li>
</ol>
3 일
3. 1 차적인 항 체 외피입니다.
<ol>
	<li>PBST에서 번데기 날개 잠복기 조직 permeabilize (Triton X-100 0.2%) 부드러운 액체 중간 움직임을 촉진 하기 위하여 락 플랫폼을 사용 하 여 15 분. 
	참고: 샘플을 설치까지 단계 락 플랫폼을 사용 하 여 수행 한다.</li>
	<li>PBSTA를 사용 하 여 샘플을 차단 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 1 시간에 대 한.</li>
	<li>동일한 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 (마우스 항-Ptc, 1: 100)를 희석 하 여 4 ° c.에 하룻밤 번데기 날개를 품 어</li>
</ol>
4 일
4. 이차 항 체 외피입니다.
<ol>
	<li>워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)</li>
	<li>이차 항 체 (예, 반대로 마우스에 형광 색소 활용 된)와 함께 품 어 PBSTA에 적절 한 농도를 희석 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 2 시간에 대 한 어둠 속에서 실내 온도에. 
	참고: 적절 한 경우 조직 counterstain를 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 phalloidin을 사용 합니다. 이차 항 체의 신호의 중복을 방지 하기 위해 형광 방출 파장을 고려와 함께이 프로브를 추가 합니다.</li>
	<li>워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)</li>
</ol>
5입니다. 장착
<ol>
	<li>마치 그들은 사각형의 꼭지점 현미경 슬라이드에 투명 한 매니큐어의 4 점 들을 배치 하 여 샘플 슬라이드를 준비 합니다.</li></ol>포인트는 coverslips 나머지 것입니다 있을 것입니다 그들은 조직을 분쇄 방지 하는 데 도움.
	<li>미디어 (글리세롤/트리 스-HCl 80%)의 모서리 (점)을 건드리지 않고 매니큐어로 만든 점 들의 사각형의 중심에 장착의 장소 30 µ L. 노란 자른된 팁과 피 펫을가지고, 일부 설치 미디어를 로드 하 고 여러 번데기 날개에 그립니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드에 미디어를 마운트의 도트에 번데기 날개를 전송. 팁의 도움으로 설치 미디어를 확산 하 고 부동에서 그들을 방지 하기 위해 번데기 날개를 싱크 합니다. 커버 유리에 배치 되는 날개 평면 유지 하는 경우 조직의 형태를 유지 됩니다. 커버 유리를 배치 하기 전에 공기 방울을 제거 합니다.</li>
	<li>기포의 생성을 방지 하려는 샘플에 coverslip 낮은. 이 움직임은 겸의 도움으로 할 수 있습니다.</li>

<ol><li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+morphogenesis%3A+connections+between+patterning+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li>
<li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li>
<li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing%3A+initiation+of+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li>
<li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing%3A+The+development+of+the+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li>
<li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61(2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 비디오에서 설명 하는 해 부의 방법은 다양 한 기법에 대 한 다른 개발 단계에서 초파리 번데기 날개의 높은 품질의 샘플을 준비 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 면역 형광 검사, PCR 분석 실험, cDNA 합성 생체 외에서 개발 날개). 이 방법의 관점에서 관련 된 과학자 24-30 h APF를 사용 했습니다. 그러나 젊은 이상 번데기의 해 부에 필수적인 단계 내에서 아무런 장애물이 있어야 한다. 변화는 작은 무대 번데기를 수용 하 여야 할 수 있습니다.
프로토콜 한 번데기 또는 여러 pupae 동시에 해 부를 수행 수 있습니다. 쉽게 해 부 날개의 많은 수를 도달 하는 절차를 가속 수 있습니다. 이 경우 동시에 4-5 pupae의 행을 제거 하는 옵션이입니다. 함께 번데기를 제거 하거나 불가능, 계속 동일한 슬라이드에 개별적으로 제거할 수 있습니다 (III 비디오의 섹션을 참조 하십시오: "여러 pupae 해 부"). 에서...

초파리 날개 날개 imaginal 디스크에서 개발 된다. 이러한 날개 디스크의 원시 배아 상피에서 invaginate는 20-30 imaginal 셀의 작은 그룹으로 배아 개발 하는 동안 옆으로 배치 됩니다. 유 충 탈피 세 번째 단계로 성장 하는 동안 유사 분열에서에서 발생 합니다 imaginal 셀에 특정 특성의 숫자 (약 50000 셀)을 제기 하 고 날개를 형성 디스크1,2,3, 4. 셀 확산, 그들은 패션 관 상피, 자동 접이식 소형 나선 결과. Pupation, 동안 디스크 상피 형태 2 층 날개 밖으로 망원경 그리고 경도 정 맥 시작 그들 사이 격차는 날개 발달5,6동안 두 번 발생 합니다.
항상 혈관의 배치는 동일한 패턴; 쉽게 모든 변경 내에서 혈관 형성을 식별 하는 기능 돌연변이 매우 표시 (예: 누락 되거나 추가 정 맥, 정 맥의 위치, 등등에서 변화.) 합니다. 흥미롭게도, 표현 형 변이 일반적으로 신호 경로 날개 개발와 관련 된 알려진 또는 소설 구성에 돌연변이의 증거. 경로 위치를 결정 하 고 정 맥 및 intervein 영토를 유지 하는 역할을 수행 중 이다 Hedgehog (Hh) 통로6,,78.
모델 시스템으로 번데기 날개의 중요성을 감안할 때, 그것은 함께 작동 하도록 좋은 품질 샘플을 얻기 위해 중요 한 됩니다. 과거에는, 날개 초파리 해 부 프로토콜 게시 과학자 하지 실행할 수 있는 샘플을 달성 하기 위해 적절 한 가이드를 주었을 합니다. 연구원의 지도 없이 하나 명확 하 게 과정을 시각화 수 없습니다. 이러한 대체 해 접근 번데기 2, 조직 주위에서 날개 분리 분할 이며 반복적으로 파편을 제거 하기 위하여 세척. 이런이 종류의 자유로운 날개를 두고 접근 주장의 오염 하지만 이전 경험 때문에 프로세스는 느린 고 연약한 날개9의 구조를 손상의 더 높은 기회가 있다.
여기에 설명 된 절차를 특정 단백질 또는 사본 immunodetection 프로토콜 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험을 사용 하 여 적합 한 번데기 날개 샘플 받는 신속 하 고 효율적인 방법을 찾을 수 수요에 의해 개발 되었다. 이 표현과 패치 (Ptc 또는 Hh 통로의 정식 수용 체)의 지역화를 설명 하기 위해 번데기 날개 샘플을 성공적으로 수행 완료 관련 세부 정보를 포함 하는 프로토콜을 제공에서 발견 되 절차입니다.

<table><tbody><tr><td>시원한 빛 조명이 있는 실체 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td>SMZ1000</tr><tr><td>흔들 플랫폼</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경(24 x 32mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 플라스틱 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 또는 p200 피펫</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>바이오 베이직 INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리 수</td><td>MO. BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 2 mg / mL (작업 희석 1/800)</td> <td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &mu; g/mL (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>NICHD의 후원하에 DSHB의 Isabel Gerrero가 제작하고 아이오와 대학교, 생물 과학과, 아이오와 시티, IA 52242에서 유지 관리.</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000)</td>Alexa 488에 접합된 <td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin, 300 U/1.5 mL 메탄올 (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (플라이 스톡)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

번데기 날개 초파리 immunodetections 또는 pcr 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

초파리 melanogaster 의 날개 개발 조직 수준에서 morphogenesis 공부에 대 한 이상적인 모델입니다. 이러한 부속 라는 날개 imaginal 디스크 배아 발달 동안에 형성 하는 세포의 그룹에서 개발. 애벌레 단계에서 imaginal 디스크 성장, 세포의 수를 증가 하 고 monolayered 상피 구조를 형성. 번데기의 경우, 내부 imaginal 디스크 밖으로 새싹 되는 날개의 앞 여백 선 따라 bilayers에 접어. 이 과정 동안, 경도 primodia 정 맥 정 맥 셀 날개의 장래 등 쪽과 복 부 표면에 시작 됩니다. 번데기 단계에서 각 표면의 정 맥 세포의 줄무늬 꽉 튜브;를 생성 하기 위해 의사 소통 동시에 간 정 맥 그들의 형성을 시작합니다.
적절 한 분자 마커의 도움으로 개발 하는 동안 날개를 구성 하는 주요 요소를 식별 가능 하다. 이러한 이유로 정확 하 게이 구조에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍요로 움과 날개의 개발 프로세스에 관련 된 지역화를 공부 하 고 중요 합니다.
절차는 여기 조작 번데기 날개, 날개를 해 부하는 번데기 단계에서 하는 방법에 자세한 지침을 제공에 초점을 맞추고 설명 합니다. 번데기 조직의 해 부 3 탈피 애벌레에 있는 그들의 대조 물 보다 수행 하기 위해 더 어렵습니다. 이 때문에이 이렇게 신속 하 고 효율적인 고품질 샘플을 얻기 위해, 개발 되었다. Immunostain 및 마운트 하는 방법의 세부 사항은 단백질 또는 세포 구성 요소, 시각화 수 있도록 이러한 날개 샘플 프로토콜에서 제공 됩니다. 작은 전문 그것 시간의 짧은 금액에 8-10 고품질 번데기 날개를 수집 가능 하다.

프로토콜에는 날개의 익숙한 형태를 유지 하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위해 간단한 방법을 제공 합니다. 이 준비에서 2 차원 또는 3 차원 분포 및 날개의 분화 중 단백질의 농축 조사로 예상 될 수 있는 이미지의 더미를 얻을 수 있다. 유사한 프로토콜 수집 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA), PCR 반응에 사용 된 서식 파일을 합성 하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플 (관련 된 50-80 번데기 날개)를 사용할 수 있습니다 (2.9에 참고 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55854/55854fig1.jpg"> 
그림 1 :에서 hedgehog 통로 유전자 <str...

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

본 절차의 전반적인 목표는 면역 검출 또는 PCR 분석에 적합하도록 Drosophila의 번데기 날개를 신속하고 효율적으로 해부하는 방법을 제공하는 것입니다. 여기에 기술된 절차는 PCR 분석이나 면역 검출 프로토콜을 수행하는 데 적합한 번데기 날개 샘플을 얻기 위한 빠르고 효율적인 방법을 찾고자 하는 요구에 따라 개발되었습니다. 젖은 붓을 사용하여 0시간 APF 번데기를 배양 바이알에서 조심스럽게 꺼내 새 바이알에 옮겨 발달 기간을 완료하도록 합니다.예를 들어, APF 후 24시간 된 번데기를 사용하는 경우, 바이알에 22시간 동안만 둡니다. 22시간이 되면 번데기를 양면테이프가 부착된 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 이때 번데기의 손상을 방지하기 위해 붓을 사용하여 옮길 수 있습니다.번데기는 등쪽이 위로 향하게 하고 머리 끝이 모두 같은 방향을 바라보도록 일렬로 배치해야 합니다. 그 후, 현미경 슬라이드를 일정 온도로 되돌리고 번데기가 적절한 발육 시간을 완료하도록 둡니다. 이 경우에는 24시간이 됩니다.양면테이프가 부착된 현미경 슬라이드는 번데기 껍질을 제거하기 위한 임시 해부 플랫폼으로 사용됩니다. 현미경 슬라이드 위에서 2시간 동안 번데기 껍질이 건조되면, 핀셋으로 쉽게 부술 수 있는 상태가 됩니다. 해부의 첫 번째 단계는 사체에서 번데기를 분리하는 것입니다.그 다음 번데기를 양면테이프가 부착된 다른 슬라이드로 옮깁니다. 이때 외피(carcass)는 남겨둡니다. 이 번데기는 배면(ventral side)이 위를 향하도록 하여 테이프 중앙에 고정시킵니다.날개 절단(wing cut)을 수행하기 전에, 면역조직화학법을 이용한 절차에 따라 번데기를 용액으로 덮어야 합니다. 이 용액은 고정제 역할을 하며, 이를 통해 날개를 큐티클에서 분리할 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 번데기 껍질에서 뚜껑(operculum)을 조심스럽게 제거하십시오.포셉을 사용하여 번데기의 측면을 따라 미측 끝부분까지 선을 긋듯이 케이스를 절개합니다. 적절한 조명을 사용하면 번데기의 내부 형태를 시각화할 수 있으며, 번데기 날개 경첩 바로 위에 분명한 공간이 나타납니다. 이 공간은 번데기에 손상을 주지 않고 개방 작업을 수행하기 위한 가이드 역할을 합니다.케이스를 측면으로 열면, 열린 가장자리를 잡아 들어 올려 반대편으로 옮긴 뒤 양면테이프로 고정함으로써 케이스의 일부를 제거할 수 있습니다. 해부가 끝나면 번데기는 거의 외피가 없는 상태가 됩니다. 케이스의 일부분만이 후단 끝부분을 덮고 있게 됩니다.포셉을 사용하여 케이스의 나머지 부분을 부드럽게 누릅니다. 이 동작을 통해 번데기의 안쪽 끝이 들어 올려지며, 머리와 가슴 부분이 다음 단계에서 고정되기 좋은 위치에 놓이게 됩니다. 양면테이프가 붙은 새 슬라이드 글라스를 준비하여 번데기 위에 뒤집어 놓습니다.그 다음, 번데기가 테이프에 달라붙도록 살짝 누른 뒤, 슬라이드를 조심스럽게 밀어 넣어 나머지 케이스들로부터 번데기를 분리합니다. 현미경 슬라이드를 뒤집습니다. 번데기는 머리 또는 흉부 부위 높이의 등 쪽에 붙어 있을 것입니다.면역조직화학 염색을 위해, 4%paraformaldehyde로 나체 번데기 전체를 덮습니다. 고정액에서 10분 후, 가위를 사용하여 날개 경첩 부위 또는 그 주변에 작은 절개를 냅니다. 고정액이 날개 상피에 도달하도록 합니다.그 후 5분이 지나면, 핀셋을 사용하여 큐티클 경계면부터 찢어 구멍을 넓힘으로써 큐티클 주머니로부터 날개 상피를 분리합니다. 날개 조직이 분리되면, 총 30분 동안 고정이 완료될 때까지 파라포름알데히드 용액에 그대로 둡니다. 이 영상에서 설명한 해부 방법은 다양한 발달 단계의 Drosophila 번데기 날개에서 여러 종류의 기법에 사용할 고품질 샘플을 준비하는 데 활용될 수 있습니다.본 프로토콜은 번데기 한 마리 또는 여러 마리를 동시에 해부하는 방식으로 수행할 수 있습니다. 이는 절차 속도를 높여 더 많은 수의 날개를 해부하는 것을 용이하게 합니다. 개방된 고치에서 나체 번데기를 제거하기 위해서는 후단 팁의 크기가 충분히 작은 것이 중요합니다.네 다섯 줄의 나체 번데기를 동시에 제거하는 것이 가능하지만, 단일 양면테이프를 사용하여 케이스에 붙어 있는 나머지 번데기들을 연속적인 단계로 제거할 수 있으므로 이는 중요한 점이 아닙니다. 이것은 24-30시간 APF 날개의 공초점 이미지입니다. 염색 결과는 hedgehog의 정준 수용체인 patched 단백질, 핵 및 액틴 필라멘트의 발현을 보여줍니다.mRNA를 분리하기 위해 더 큰 날개 샘플을 얻으려면 이와 유사한 해부 과정을 사용할 수 있습니다. 이 mRNA는 PCR 반응에 사용할 수 있는 cDNA를 합성하는 데 쓰일 수 있습니다. 여기에서는 patched와 actin의 발현을 검출하여 얻은 생성물을 보여줍니다.본 프로토콜은 날개의 익숙한 형태를 유지하면서 번데기 날개 샘플을 얻을 수 있는 간단한 방법을 제공합니다. 이러한 준비 과정을 통해, 날개의 분화 과정 중 단백질의 분포 및/또는 농축을 조사하기 위해 2D 또는 3D 이미지로 투영할 수 있는 이미지 스택을 얻는 것이 가능합니다. 이와 유사한 프로토콜을 사용하여 PCR 반응에 필수적인 분자인 cDNA를 합성하는 데 필요한 대량의 번데기 날개 샘플을 수집할 수 있습니다.본 절차는 이미 발표된 번데기 날개 해부법에 대한 대안적이고 보완적인 접근 방식을 제공합니다.

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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번데기 기간 및 측정 초파리 guttifera 의 날개 염색의 준비에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 준비와 염색의 정량화 성인 특성의 발달 기계 장치를 공부에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 특성 개발의 interspecific 비교 사용.

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여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

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오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

본 프로토콜은 초파리 번데기 노툼의 고정 조직의 준비 및 시각화를 자세히 설명합니다. 그것은 손상되지 않았거나 상처 입은 조직에 사용할 수 있으며 조직의 원래 구조는 보존됩니다. 해부, 고정 및 염색 절차는 모두이 기사에서 설명합니다.

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배우세요 Drosophila 번데기 날개를 신속하게 분리하는 방법으로, 면역검출 및 PCR 분석에 적합한 샘플을 얻어 전사체와 단백질 발현 연구를 효율적으로 수행할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

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