Стратегическая эндотелиальных клеток Tube Формирование анализа: Сравнение внеклеточного матрикса и фактор роста Снижение внеклеточного матрикса

Общая цель данного эксперимента заключается в количественной оценке зависимости эндотелиальных клеток от ангиогенных хемокинов с использованием двух различных внеклеточных матриц, содержащих компоненты, которые связываются с различными ангиогенными молекулами. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области ангиогенеза рака, такие как: почему ангиогенез поддерживается альтернативными путями с использованием изменений во внеклеточном матриксе? Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он поддается количественной оценке и использует меньше переменных.

Демонстрировать процедуру будет мисс Донхонг Джу, научный сотрудник лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, разморозьте либо внеклеточный матрикс СКФ, либо нормальный внеклеточный матрикс в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Держите 96-луночный планшет на льду и добавляйте 50 микролитров охлажденного внеклеточного матрикса на лунку с помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток.

Готовят тройки из пяти лунок, содержащих только нормальный внеклеточный матрикс, а затем тройки из пяти лунок, содержащих только внеклеточный матрикс СКФ. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут промойте HUVEC один раз PBS, без кальция и магния, и добавьте один миллилитр 05% трипсина ЭДТА.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной-пяти минут и проверяйте их каждую минуту, пока большинство клеток не округлится. Затем выбейте ячейки, постучав по колбе. После этого добавьте в колбу пять миллилитров базальной среды с одним процентом FBS.

Переложите клетки в 15-миллилитровую трубку. Затем центрифугируйте клетки при 200-кратном G в течение пяти минут. Через пять минут откажитесь от надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки двумя миллилитрами базальной среды.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте концентрацию клеток с точностью до двух-трех умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр. Затем приготовьте 100 микролитров пяти различных 10-кратных концентраций ингибитора CXCR2 в базальной среде. Пипеткой введите 300 микролитров суспензии HUVEC в каждую из пяти отдельных микроцентрифужных пробирок.

Затем добавьте по 33 микролитра ингибитора 10Х каждой концентрации в пробирки, содержащие HUVEC, и сделайте их вихревыми. Далее пипеткой впрыскиваем по 50 микролитров каждой из клеточных суспензий в отдельные лунки внеклеточного матрикса. Положите каждую суспензию в три раза и инкубируйте от четырех до 16 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого сделайте по четыре снимка из каждой лунки с помощью камеры с перевернутым микроскопом. В этой процедуре подготавливают внеклеточный матрикс и планшеты в соответствии с теми же спецификациями, что и при анализе формирования трубки. После этого приготовьте суспензию HUVEC и аликвоту в 96-луночный планшет, содержащий внеклеточный матрикс, по 50 микролитров на лунку.

После этого выращивайте клетки на внеклеточном матриксе в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем сделайте снимки до начала медикаментозного лечения. Затем приготовьте пять различных двух концентраций X ингибитора CXCR2 в базальной среде.

Добавьте по 50 микролитров ингибитора CXCR2 каждой концентрации в каждую из 96 лунок, содержащих HUVEC. После этого инкубируйте планшет еще от двух до 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем сделайте четыре снимка каждой скважины с помощью камеры инвертированного микроскопа.

Чтобы оценить образование трубки, запечатленное на изображениях, измерьте общую длину трубки в четырех случайных микроскопических полях с помощью программного обеспечения камеры микроскопа. Для этого откройте изображение в программном обеспечении камеры микроскопа и нажмите «Аннотации и измерения». В разделе Длина выберите инструмент простой линии.

Нажмите на изображение, затем проведите линию по длине трубы, затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выполнить расчет. После этого повторите процедуру для всех линий трубки на изображении, выбрав инструмент «Простая линия». Нажмите на изображение, проведите линию по длине трубки, затем щелкните правой кнопкой мыши.

Программное обеспечение будет записывать длину каждой строки и выводить данные на экран. После измерения каждой трубки на рисунке нажмите «Экспорт», затем выберите «Длина в таблицу», чтобы экспортировать данные о длине в таблицу. Сложите все длины трубок из таблицы, чтобы получить общую длину трубки.

Далее рассчитайте и запишите среднюю длину трубок. В этой процедуре культивируют и проводят анализ формирования трубки в 12-луночном планшете. Инкубируйте клетки в течение от четырех до 16 часов, чтобы образовались трубки.

После этого аспирируйте среду для клеточной культуры и промойте клетки одним миллилитром холодного 1XPBS без кальция и магния. Затем добавьте в культуру один миллилитр ледяного буфера PBS с 2,5 миллимолярной ЭДТА и подержите его на льду в течение 10 минут. Через 10 минут извлеките клетки и смесь внеклеточного матрикса из чашки с помощью наконечника пипетки объемом 1000 микролитров с отрезанным кончиком.

Затем перенесите клетки в холодную 15-миллилитровую трубку. Промойте колодец четырьмя миллилитрами ледяного PBS и положите в ту же пробирку. Затем положите трубку на лед на один-четыре часа и переверните трубку несколько раз, пока внеклеточный матрикс не растворится.

После этого центрифугируйте его в течение 10 минут при нуле градусов Цельсия. Затем повторно подвесьте клеточный поддон с одним миллилитром холодного PBS в 1,5-миллилитровую пробирку на лед. Снова центрифугируйте его в течение пяти минут при нуле градусов Цельсия.

Затем утилизируйте надосадочную жидкость и храните клетки при температуре 80 градусов Цельсия. Эти два изображения показывают успешное формирование эндотелиальной трубки на нормальном внеклеточном матриксе и внеклеточном матриксе СКФ. Взаимосвязанная сеть трубок ясно показывает, что рост трубок в этих HUVEC здоровый.

Эти два изображения показывают ингибирование образования трубок ингибитором CXCR2, SB225002, на 5,6 микромолях на нормальном внеклеточном матриксе и внеклеточном матриксе СКФ. Изолированные скопления HUVEC, видимые на этом изображении, показывают, что клетки не смогли сформировать необходимые трубки для соединения друг с другом. Этот график показывает, что ответ HUVEC на ингибитор CXCR2 на внеклеточном матриксе СКФ является дозозависимым.

После процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как QRTPCR или секвенирование РНК с использованием подготовленных клеток. Такие данные, как средняя длина трубки, общее количество трубок или общее количество точек ветвления, могут быть получены с помощью изображений для характеристики процесса ангиогенеза в экспериментальных условиях.