HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

この手法の全体的な目的は、単一の超高性能液体クロマトグラフィー質量分析（UHPLC-MS）アッセイを用いて、化合物のHDAC阻害能を決定し、細胞内におけるHDAC6またはHDAC1に対する選択性を特定することです。本手法は、HDAC阻害剤が生細胞においてクラスI HDACよりもHDAC6に対して選択的であるかを確認するなど、創薬分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、細胞、阻害剤、および選択的基質を一度インキュベートするだけで、2つのHDACアイソフォームに対する効力を同時に決定できることです。

この手法は、内因性タンパク質のアセチル化アッセイを回避し、生存細胞内でHDAC6の選択性が維持されているかを確認できるため、選択的HDAC阻害剤の早期創薬への応用が期待されます。本法ではHeLa細胞を用いてHDAC阻害剤の選択性を評価していますが、原代細胞や臨床検体を含む他の腫瘍細胞などの他の細胞株にも適用可能です。10%胎児牛血清、ペニシリンG、およびストレプトマイシンを添加した最小必須培地を用いて、T75細胞培養フラスコ内でHeLa細胞を80%コンフルエンスまで培養します。

Dulbecco's Phosphate-Buffered Salineを5 mLを用いて、細胞を2回洗浄します。次に、バッファーを吸引し、細胞解離試薬を1 mL加えます。細胞を剥離させるため、37 °Cで5分間インキュベートします。

5分後、細胞にMEM培地を9 mL加え、細胞懸濁液を十分に再懸濁します。細胞を新しい15 mLチューブに移し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。MEM中での細胞懸濁液の密度を 60,000 cells/mL に調整します。

次に、滅菌済みの組織培養処理済み平底96ウェルプレートのコントロールウェルおよびテストウェルに、細胞懸濁液を100 µLずつ加えます。その後、96ウェルプレートのブランクウェルにMEM培地を100 µL加えます。この96ウェルプレートを37 °Cで24時間インキュベートします。

96ウェルプレートのウェルから培地を吸引します。培地を吸引する際、ウェルから細胞を剥離・除去しないように注意してください。これは、吸引速度を低く設定し、吸引チップをウェル表面の底隅に慎重に配置することで達成できます。

次に、Trichostatin A、MS275、および Tubastatin A を含む、MEMで調製した2倍濃度の被験化合物を25 µLずつ試験ウェルに加えます。コントロールウェルおよびブランクウェルには、MEMを25 µLずつ加えます。続いて、コントロールウェルおよび試験ウェルに、基質混合液を25 µLずつ加えます。最後に、ブランクウェルにMEMを25 µLずつ加えます。

96ウェルプレートを、加湿された5% 二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで8時間インキュベートします。細胞溶解を行うため、まずプロテアーゼ阻害剤を添加した6倍濃度のRIPAバッファーを10 µLずつ、96ウェルプレートの各ウェルに加えます。各ウェルに160 µLの冷アセトニトリルを加えて反応を停止させ、ピペッティングによって混合します。

プレートを-80°Cのフリーザーで10分間保持します。プレートをフリーザーから取り出し、各ウェルの内容物220µLを非滅菌の円錐底96ウェルプレートに移します。プレートを5,000×g、4°Cで10分間遠心分離します。

遠心分離後、上清 200 µL を UHPLC システムに対応した 96 ウェルプレートに移します。次に、プレートシーラーを用いて、剥離可能な熱シールフォイルでプレートを密封します。移動相システムを充填し、超高速液体クロマトグラフィー質量分析計システムを準備します。

プレートホルダーを備えたサンプルマネージャーに96ウェルプレートを設置します。本文に記載されているUHPLC ESI MS/MS条件に従ってサンプルを分析します。データ解析を行うには、適切なUHPLCインテグレーションソフトウェアを用いて、各基質およびその脱アセチル化生成物のピーク面積を積分します。

各基質について、各クロマトグラムにおける脱アセチル化体とアセチル化体のピーク面積比を算出します。これには試験サンプルとコントロールサンプルの両方を含めてください。最後に、テキストプロトコル内の式に従って、各試験サンプルのHDAC阻害率（%）を算出します。

サンプルのUHPLC-MSクロマトグラムをここに示します。細胞に添加した基質に対応するピークは、書面プロトコルの表1に記載されている質量遷移に従って検出されます。MOCPACはHDAC1によって脱アセチル化され、脱アセチル化MOCPACピークを生じます。

同様に、BATCPはHDAC6によって脱アセチル化され、脱アセチル化BATCPピークを与えます。最後に、MALは脱アセチル化MALピークを提供し、これはいくつかの内因性HDACの非特異的な脱アセチル化を反映しています。ここに、異なる濃度のHDAC阻害剤Trichostatin Aを用いて得られたクロマトグラムの図を示します。標準的なHDAC阻害剤の用量反応評価が行われました。

MOCPACおよびdMOCPACから得られた積分値を用いて、HDAC1に対する標準阻害剤の効力を算出した。IC 50の算出結果、選択的クラスI HDAC阻害剤であるMS275は、既知のHDAC6阻害剤であるTubastatin AよりもHDAC1に対して低いIC 50値を示した。一方、BATCPおよびdBATCPから得られた単離値を用いて、HDAC6に対する標準物質の効力を算出した。

今回、Tubastatin AはMS275よりも低いIC 50値を示し、それらのアイソフォーム選択的プロファイルが確認されました。Trichostatin Aは、強力で非選択的な阻害剤です。この手法を習得すれば、細胞処理時間と96ウェルプレートの解析を含め、適切に実施することで72時間で完了させることができます。

本手順を実施する際は、ここに記載されているインキュベーション時間はHeLa細胞に対するものであることに留意してください。別の細胞株を使用する場合は、最適化が必要です。本手順に従うことで、特異的な基質が存在する限り、他のアイソフォームの選択的HDAC抑制活性を測定することが可能です。

有機溶媒やその他の化学薬品の使用は極めて危険であるため、本手順の実施中は必ず保護メガネ、手袋、および白衣を着用してください。