ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

このプロトコールの全体的な目標は、遺伝子発現調節や染色体凝縮など、クロマチン生物学において重要な役割を果たすヒストン翻訳後修飾の相対的な存在量を評価するための簡単な手順を提供することです。この方法は、クロマチン生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、どのヒストン修飾が、所与の細胞または組織の刺激または治療においてそれらの相対的な存在量を変化させるかなどである。

この手法の主な利点は、質量分析ベースのプロテオミクスを使用することで、既知のタンパク質上の既知のPTMのほとんどを1回の分析で同時に定量できることです。ヒストン修飾解析は、薬物治療やストレスによる個人やモデルシステムのエピジェネティックな変化やクロマチン操作の推定など、多くの用途があります。Simoneに加えて、私の研究室の他の2人のメンバーがこのプロトコルの手順を実演します。

研究専門家のナタラジャン・バヌさんと大学院生のケリー・カーチさん。このワークフローに示されているように、これは、細胞培養または組織からのヒストン精製、ヒストン誘導体化、消化および脱塩、およびナノフロー液体クロマトグラフィーを使用した質量分析を含む10ステップのプロトコルです。このビデオでは、選択した手順のみを示します。

無傷の細胞から核を単離する手順を開始するには、以前に採取して摂氏マイナス80度で保存した細胞を氷上で解凍します。そして、プロトコルのテキストに記載されているように、核分離バッファー(NIB)を準備します。ペン先5分の1の容量を取り除き、NP-40 Alternativeを最終濃度0.2%まで追加します残りの5分の4の容量は洗浄に使用されます。

NP-40 Alternativeを使用せずに、細胞ペレットの容量とバッファー容量の1:10の比率を使用して、細胞ペレットをNIBで洗浄します。700 RCFで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。氷上に入れ、0.2%NP-40 Alternativeと共にNIBを細胞ペレット容量とバッファー容量の比率が1:10になるように添加して、細胞ペレットを溶解します。

穏やかなピペッティングにより細胞を均質化します。ホモジナイズした細胞を氷上で5〜10分間インキュベートし、細胞が溶解して核を放出します。1000 RCFで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。

ペレットには主に細胞核が含まれ、上清には主に細胞質成分が含まれます。必要に応じて、細胞質画分を保存します。NP-40 Alternativeを使用せずに、ペレット容量とバッファー容量の比率が1:10の比率で、核ペレットをNIBに穏やかに再懸濁して、核ペレットを洗浄します。

1000 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離し、スーパーナテントを取り出します。NP-40 Alternative を核ペレットから完全に除去した後、氷冷した 0.2 モルの硫酸を核体積と硫酸体積の 1:5 の比率で加えます。穏やかなピペッティングにより、核を硫酸に再懸濁します。

サンプルを一定の回転でインキュベートするか、摂氏4度で2〜4時間穏やかに振とうします。次に、サンプルを摂氏4度で3400 RCFで5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。再度遠心分離し、上清を新しいチューブに移して、不溶性物質を取り除きます。

ヒストンを沈殿させるには、冷やした100%トリクロロ酢酸(TCA)を、回収した上清に1:3の体積比で加えます。ヒストンの存在は、サンプルが曇ることによって示されます。チューブを数回反転させて混ぜます。

混合物を氷上で少なくとも1時間インキュベートします。3400 RCFで5分間遠心分離します。遠心分離後、ヒストンはチューブの側面をコーティングし、底部にも堆積します。

チューブの一番下にも白い不溶性のペレットが形成され、そのほとんどが非ヒストンタンパク質やその他の生体分子を含んでいます。チューブの側面やチューブの底のペレットをこすらないように、吸引によって上清を慎重に取り除きます。ガラス製のパスツールピペットを使用して、100%氷冷アセトンと0.1%塩酸でチューブをすすぎ、側面と底部を覆う沈殿したタンパク質を覆います。

3400 RCFで2分間遠心分離します。上清を慎重に吸引し、側面やペレットをこすらないようにします。チューブを100%氷冷アセトンですすぎ、再度遠心分離し、側面やペレットをこすり落とさずに上清を取り除きます。

その後、ヒストンの定量と純度分析をプロトコールテキストに記載されているように行います。逆相HPLCによるヒストン変異体の任意の分画も、ヒストン誘導体化の前に行うことができます。この手順は、ヒストンサンプルを40マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム(pH 8.0)に溶解することから始めます。

P10ピペットチップを吸引せずにサンプルに挿入し、ピペットチップをpHインジケーターストリップに触れて、pHを確認します。水酸化アンモニウムとギ酸を使用して、pHを8.0に調整します。これ以降、無水プロピオン酸の使用を含むすべてのステップは、ヒュームフードで実行する必要があります。

無水プロピオン酸を反応性に保つために、一度に最大3〜4個のサンプルを処理します。無水プロピオンとアセトニトリルを1:3の容量比で混合することにより、新鮮なプロピオン化試薬を調製します。プロピオニル化試薬を各サンプルに1:4の容量比で添加します。

水酸化アンモニウムを迅速に添加して、溶液にpH 8.0を再確立します。通常、pH 8.0 を再確立するには、容量比 1:5 の水酸化アンモニウムをサンプルに添加するのが適切です。ボルテックスですぐに混ぜます。

pHを確認してください。サンプルを室温で15分間インキュベートします。すべてのサンプルがプロピオニル化を受けた後、真空濃縮器でサンプルを10〜20マイクロリットルまで乾燥させます。

最終容量が40マイクロリットルに達するまで、サンプルをddH20で再懸濁または希釈します。塩は液体クロマトグラフィーや質量分析の妨げとなるため、分析前にサンプルを脱塩する必要があります。このビデオでは、ステージチップの構造のみを示します。

P1000ピペットチップを使用して、固相抽出ディスクからC18材料のディスクをパンチします。フューズドシリカキャピラリーを使用して、ミニディスクをP1000チップからP100またはP200ピペットチップの底に押し出します。ディスクが先端の下部にしっかりとくさびで留められていることを確認します。

25 マイクログラムを超えるサンプルを脱塩する場合は、同じ P100 または P200 チップに 2 つの C18 ミニディスクを使用します。遠心分離機アダプターを使用して、ステージチップを1.5ミリリットルまたは2ミリリットルの微量遠心チューブの所定の位置に保持します。50マイクロリットルの100%アセトニトリルで紡糸して樹脂を洗い流し、C18材料を活性化し、潜在的な汚染物質を取り除きます。

その後、サンプルの脱塩は、プロトコルテキストに記載されているように実行されます。ヒストンペプチドは、さまざまな同重体形態で存在します。ヒストン分析で一般的に豊富に見られる2つの例を示します。

上記のように、それらの前駆体質量と相対同位体の抽出イオンクロマトグラムは同じです。ただし、以下に示すプロダクトイオンの抽出イオンクロマトグラムでは、2 つの同重体型を区別できます。赤で強調表示された一意のフラグメントイオンのみを使用して、2つの種の相対的な存在量を推定する必要があります。

ヒト胚性幹細胞から抽出したヒストンを、レチノイン酸刺激の有無にかかわらず分析しました。2つのヒストンH3ペプチドの相対定量により、ヒト胚性幹細胞のアセチル化が明らかに減少し、分化が促進されることが明らかになりました。これは、分化細胞と比較して、胚性幹細胞におけるアセチル化が高いという以前の報告と一致しています。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば3日で完了します。1日はヒストン抽出、2日目はタンパク質誘導体化と消化、3日目はペプチド誘導体化、ステージティッピング、LC-MS分析です。ヒストン精製は、ペプチドの分析以外の目的、例えばミドルダウンプロテオミクスやトップダウンプロテオミクスなど、ヒストンの修飾を特徴づけることが可能です。

このビデオを見れば、質量分析ベースのプロテオミクスを使用してヒストンの翻訳後修飾を同定し、定量する方法を十分に理解できるはずです。