タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

この手順の全体的な目的は、哺乳類細胞からタンパク質複合体を効率的に単離することです。まず、目的のタンパク質を発現させるために、HaloTag融合コンストラクトを細胞に導入（トランスフェクション）します。次に、細胞を溶解させ、HaloTagを介してレジン上にタンパク質複合体を共有結合的に捕捉します。

次に、非特異的な相互作用を除去するために、レジン上のタンパク質複合体を穏やかに洗浄します。最終ステップは、レジンからタンパク質複合体を溶出させることです。最終的に、HaloTagプルダウン法を用いて、哺乳類システムから新規のタンパク質相互作用を単離および探索します。

本日ご紹介する手法を用いることで、新規のタンパク質相互作用の同定や細胞内におけるタンパク質の局在決定など、機能プロテオミクスの分野における重要な発見が可能になります。本手順の実演を行うのは、シニアサイエンティストのJackie MendezとAlen Beekです。まず、各融合タンパク質またはコントロールについて、15 cmディッシュを1枚用意し、3〜4 × 10⁵ cells/mLの密度で30 mLの細胞を、あるいはコンストラクトあたり合計1〜1.2 × 10⁷ cellsを調製します。

細胞を37°C、5%CO2条件下で18〜24時間インキュベートします。インキュベーション後、目的のトランスフェクション試薬を用いてコンストラクトをトランスフェクションします。トランスフェクションから24〜48時間後、培地を除去し、氷冷したPBS 20〜25 mLで細胞層を穏やかに洗浄します。PBS洗浄液を除去し、4°Cに冷却したPBS 25〜30 mLを加えます。

その後、セルスクレーパーを用いてディッシュから細胞を静かに掻き取ります。細胞をコニカルチューブに回収した後、2000 ×g、4 °Cで5〜10分間、サンプルを遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを-80 °Cで最低30分から最大6ヶ月間保存します。

各融合サンプルまたはコントロールサンプルについて、レジン平衡化洗浄バッファーを18 milliliters調製します。バイアルを反転させてレジンを穏やかに混合し、均一な懸濁液にします。各プルダウン実験につき、200 microlitersのレジンを1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに分注します。

サンプルを 800 ×g で1分間遠心分離します。遠心分離後、チューブ底部のレジンを乱さないように注意して、上清を慎重に取り除きます。上清を捨てた後、800 µL のレジン平衡化洗浄バッファーをサンプルに加え、チューブを数回反転させて十分に混ぜ合わせます。その後。

サンプルを800 ×gで2分間遠心分離します。上清を注意深く取り除いて廃棄してください。以上の手順をさらに2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。

解凍した細胞ペレットを、あらかじめ調製した300 µLの哺乳類細胞溶解バッファーでピペッティングにより再懸濁します。その後、新しいマイクロ遠心チューブに移し、50 x プロテアーゼ阻害剤カクテルを6 µL加えます。

その後、3 µLのRQ one DNAsを加え、サンプルを10分間転倒混和します。室温で、サンプルを25または27ゲージの注射針に5〜10回繰り返し通し、細胞を溶解させます。サンプルを4 °Cで14,000 ×gで5分間遠心分離した後、上清の溶解液を新しいチューブに移し、氷上に置きます。

次に、事前に調製した1X TBSバッファーをさらに700 µL加え、ピペッティングによって十分に混合します。事前に調製し平衡化したレジンチューブから、チューブ底部のレジンを乱さないようにして、最終洗浄液を除去します。その後、希釈した溶解液を各チューブに1 mLずつ加えます。

チューブローテーターを用い、22 °Cで15分間混合しながらサンプルをインキュベートします。その後、樹脂が入ったチューブを800 ×gで2分間遠心分離します。上清を捨てた後、樹脂平衡化洗浄バッファーを1 mL加え、各樹脂チューブを手で数回反転させて十分に混合し、再び800 ×gで2分間遠心分離します。この洗浄工程を計3回繰り返した後、洗浄液を捨てます。

サンプルを22 °Cで5分間、定速回転させながらインキュベートした後、レジン平衡化洗浄バッファーを1 mL加えてください。レジンチューブを800 ×gで2分間遠心分離し、洗浄液を捨てます。この時点で、各サンプルのレジンを50 µLのSDS溶出バッファーで再懸濁します。自動マイクロ遠心チューブシェーカーを用い、室温でチューブを30分間振盪してください。

800 ×g で2分間遠心分離した後、EITを分析用の新しいチューブに移します。ウェスタンブロットまたは銀染色の場合、質量分析用のSDS変性ゲルにサンプルの 5〜10 µL をロードします。各サンプルの 40 µL を今後の分析のために -20 °C で保存します。各融合タンパク質またはコントロールプレートの8ウェルチャンバーカバーガラスの各ウェルに、適切な培地を用いた HELOC 細胞を 1〜2 × 10⁵ cells/mL の密度で 400 µL ずつ分注します。

細胞を37°C、5%CO2条件下で18〜24時間インキュベートした後、目的のトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを行う。トランスフェクションから18〜24時間後、TMRリガンドを適切な細胞培地で1:200に希釈する。次に、この溶液を各ウェルに100 µLずつ加え、穏やかに混合する。続いて、リガンドを含むトランスフェクション済み細胞を37°C、5%CO2条件下で15分間インキュベートする。

完了後、リガンドを含む培地を吸引して除去し、タンパク質融合タグリガンドを含まず、あらかじめ37 °Cに加温した適切な培地500 µLと交換します。前の手順を2回繰り返し、計3回の洗浄を行った後、細胞をインキュベーターに戻し、30分間静置します。

30分間のインキュベーション後、培地を吸引し、37°Cに予熱した適切な培地500 µLに交換します。この後、適切な取得パラメータを用いて顕微鏡で細胞を観察し、Halo, BRD4およびHaloTagコントロールの発現を確認します。融合タンパク質の発現は、抗HaloTag抗体またはベイトタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによっても検出可能です。

Halo BRD fourおよびコントロールのプルダウンの生物学的反復試行における銀染色ゲルの結果は、高い再現性を示しており、BRD fourタンパク質と相互作用するタンパク質を明らかにしています。PTF B、CDK nine、Cyclin T、およびBRD nineタンパク質由来の成分が高含有量であることは、BRD four複合体が特異的にキャプチャされたことを裏付けています。また、これらのゲルでは、BRD fourの潜在的な相互作用因子として同定された他のタンパク質も認められました。

さらなる例として、Halo HD oneタンパク質を用いて複雑な単離を行いました。この場合、HaloタグとH DAC oneの間のリンカー領域を切断するためにTEVプロテアーゼを使用し、かなりの量のHD oneベイトタンパク質を遊離させました。観察結果は以下の通りです。

HDAC1のプルダウンサンプルでは高いHDAC1活性が示され、これはHDAC阻害剤であるsahaによって抑制されました。特異性をさらに実証するため、サーチュインファミリー阻害剤であるEX 5 27ではHDAC阻害が観察されず、バッファーのみを用いた場合にはシグナルは検出されませんでした。Halo-BRD4およびHalo-HDAC1をトランスフェクトしたHeLa細胞をTMRで蛍光標識しました。

リガンドイメージングにより、いずれも核に局在していることが示され、タグが融合パートナーの生理的な細胞内局在を変化させないことが証明されました。したがって、この手順に従うことで、単離されたタンパク質およびその相互作用パートナーを同定し、質量分析やウェスタンブロッティングなどのさまざまな分析手法を用いてさらに解析することが可能です。