タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

この手順の全体的な目標は、哺乳類細胞からタンパク質複合体を効率的に単離することです。これは、まずハロータグ融合コンストラクトで細胞をトランスセクトし、目的のタンパク質を発現させることによって達成されます。第2のステップは、細胞をスライスし、ハロータグを介して樹脂上のタンパク質複合体を共有結合的に捕捉することです。

次に、レジン上のタンパク質複合体を優しく洗浄し、非特異的な相互作用を取り除きます。最後のステップは、樹脂からタンパク質複合体を溶出することです。最終的に、ハロータグプルダウンは、哺乳類のシステムから新しいタンパク質相互作用を分離し、発見するために使用されます。

本日、ここでお見せする方法は、新規タンパク質相互作用の同定や細胞内のタンパク質局在の決定など、機能的プロテオミクスの分野における重要な発見を可能にします。今日、これらの手順を実行しているのは、私たちのシニアサイエンティストの2人、ジャッキー・メンデスとアレン・ビークです。まず、各融合または対照について、15センチメートルの皿を15センチメートル皿1枚につき10〜5個分の細胞の3〜4倍、または10〜10倍1.2倍1〜1.2倍で、15センチメートル皿を1個

細胞を摂氏37度、CO2濃度5%で18〜24時間インキュベートします。インキュベーション後、コンストラクトを目的のトランスフェクション試薬でトランスフェクションします。24〜48時間後、トランスフェクション後、培地を取り出し、細胞層を20〜25ミリリットルの氷冷PBSで穏やかに洗浄し、PBS洗浄液を取り外し、摂氏4度の冷やしたPBSを25〜30ミリリットル加えます。

これに続いて、細胞スクレーパーで皿から細胞をそっとこすり落とします。細胞を円錐管に集めたら、サンプルをGの2000倍、摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。上清を捨てた後、細胞ペレットをマイナス80°Cに最低30分間、または最大6か月間置きます。

各融合サンプルまたはコントロールサンプルについて、18 mLの樹脂平衡化洗浄バッファーを調製します。バイアルを反転させて樹脂を穏やかに混合し、均一な懸濁液を得ます。プルダウン実験ごとに、200マイクロリットルの樹脂を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分注します。

サンプルを800倍Gで1分間遠心分離します。チューブの底にある樹脂を乱さないように、上清を慎重に取り除きます。上清を捨てたら、800マイクロリットルの樹脂平衡化洗浄バッファーをサンプルに加え、チューブを数回反転させて完全に混合します。後。

サンプルを800回で2分間遠心分離します。G.上清を慎重に取り除いて捨てます。前の手順をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。

細胞ペレットを解凍した後、300マイクロリットルの予め調製した哺乳類溶解液にそれらを懸濁します。ピペッティングで上下にバッファリングします。次に、新しいマイクロ遠心チューブに移し、6マイクロリットルの50 xプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加します。

これに続いて、3マイクロリットルのRQ one DNAを加え、サンプルを10分間反転させます。室温で、サンプルを25または27ゲージのシリンジ針に5〜10回通過させることにより、細胞をlyにします。サンプルを14, 000回、Gを摂氏4度で5分間遠心分離したら、透明なライセートを新しいチューブに移し、氷の上に置きます。

次に、事前に調製した1つのXTBSバッファーをさらに700マイクロリットルの1つのXTBSバッファーを透明なライセートに加え、ピペッティングで上下させてよく混合します。あらかじめ準備した平衡化レジンチューブから最終洗浄液を取り出し、各チューブの底部にあるレジンを乱さないようにします。次に、希釈したライセート1ミリリットルを各チューブに加えます。

チューブローテーターで22°Cで15分間混合しながらサンプルをインキュベートします。この遠心分離後、レジンチューブを800倍Gで2分間、上清を廃棄した後、1ミリリットルのレジン平衡洗浄緩衝液を添加し、レジンチューブを800倍で2分間遠心分離した後、各レジンチューブを手で数回反転させて十分に混合する。G.前の洗濯を一度捨て、洗濯手順を3回繰り返します。

サンプルを摂氏22度で5分間一定回転させてインキュベートした後、チューブに1ミリリットルの樹脂平衡洗浄バッファーを加え、樹脂チューブを800倍Gで2分間遠心分離し、洗浄液を廃棄します。この時点で、各サンプルからレジンを50マイクロリットルのSDS溶出緩衝液に懸濁します。自動マイクロ遠心チューブシェーカーで室温でチューブを30分間振とうします。

800倍で2分間遠心分離した後、G.分析のためにEITを新鮮なチューブに移します ウェスタンブロットまたは銀染色ゲルの場合、質量分析用のSDS変性ゲルにサンプルの5〜10マイクロリットルをロードします。各サンプルの40マイクロリットルをマイナス20°Cで保存し、将来の分析に備えます。各融合タンパク質またはコントロールプレート用の8ウェルチャンバーカバーガラスに、各ウェル内の適切な培地中の400マイクロリットルのHELOC細胞を、1ミリリットルあたり10〜5細胞の1〜2倍の密度で充填します。

細胞を摂氏37度、CO2 5%で18〜24時間インキュベートした後、18〜24時間後に目的のトランスフェクション試薬でトランスフェクションし、トランスフェクション後、適切な細胞培地でTMRリガンドを1〜200に希釈します。次に、この溶液を100マイクロリットルを各ウェルに加え、穏やかに混合します。次に、リガンドを含むトランスフェクション細胞を摂氏37度、CO2 5%で15分間インキュベートします。

終了したら、リガンドを含む培地を吸引し、摂氏37度に事前に警告されているタンパク質融合タグリガンドを欠く適切な培地500マイクロリットルと交換します。前のステップを1回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。細胞をインキュベーターに30分間戻します。

30分間のインキュベーション後、培地を吸引し、摂氏37度に予温した500マイクロリットルの適切な培地と交換します。この画像に続いて、プロトコールhalo、BRD four、およびhaloタグコントロール発現を用いた適切な取得パラメータを用いて顕微鏡上の細胞を観察する。融合タンパク質の発現は、抗ハロタグ抗体またはベイトタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロットを使用しても検出できます。

Halo BRD 4の生物学的複製およびコントロールプルダウンの銀染色ゲルは、高い再現性を示し、BRD 4タンパク質と相互作用するタンパク質を示しています。PTF B、CDK nine、Cyclin T、およびBRD nineタンパク質からの成分が豊富に含まれていることから、BRD 4複合体の特異的な捕捉が確認されています。ゲルは、BRD 4の潜在的な相互作用として同定された他のタンパク質を示しました。

追加の例として、Halo HD oneタンパク質を用いて複雑な単離を行いました。この場合、TEVプロテアーゼを使用して、HaloタグとH DACタグとの間のリンカー領域を切断し、大量のHD Oneベイトタンパク質を放出しました。観察されたように。

HD Oneプルダウンサンプルは、HDA阻害剤sahaによって阻害された高レベルのHD One活性を示しました。特異性をさらに実証するために、サーチュインファミリー阻害剤EX 5 27ではHDA阻害は観察されず、バッファーのみを使用してシグナルは検出されませんでした。Halo BRD 4およびHalo HDAC oneをトランスフェクションしたHe A細胞をTMRで蛍光標識しました。

リガンドイメージングは、どちらも核に局在することを示し、タグがその融合パートナーの生理学的細胞局在を変更しないことを実証しました。したがって、この手順に従うと、単離されたタンパク質とその相互作用パートナーを特定し、質量分析やウェスタンブロッティングなどのさまざまな分析方法を使用してさらに分析することができます。