Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

O objetivo geral deste procedimento é fornecer com segurança e precisão um volume de injeção no miocárdio ventricular esquerdo do coração do coelho. E para fazer isso aproveitando as orientações da ecocardiografia percutânea com contraste. Isso é feito primeiro anestesiando o animal e, em seguida, preparando o tórax para o procedimento.

Em seguida, depois de colocar o coelho em um cobertor térmico e verificar se um sinal de ECG é exibido corretamente, use um sistema de ultrassom clínico para obter uma janela acústica apropriada e otimize a imagem em um amplo campo de visão. Em seguida, após carregar a seringa com células marcadas misturadas com um agente de contraste adequado e sob orientação de ultrassom, alinhe cuidadosamente a agulha oposta ao transdutor e posicione-a próxima à pele do hemitórax esquerdo, antes de avançar lentamente a agulha para a região alvo do miocárdio. Finalmente, o injetado é administrado com segurança, conforme demonstrado pela hiperecogenicidade transmural no local da injeção na imagem ecocardiográfica.

Em última análise, a confirmação ex vivo da administração bem-sucedida do injetado é demonstrada pela presença de corante no miocárdio, enquanto a análise imuno-histoquímica transversal de seções de tecido miocárdico é usada para mostrar a entrega bem-sucedida de um marcador celular e corante no miocárdio alvo. O objetivo deste vídeo é demonstrar como realizar esta técnica com segurança e precisão, para nossa possibilidade, no coelho de hoje, usando um sistema de ecocardiografia clínica. As principais vantagens desta técnica são a natureza mínima e básica da máquina e a capacidade de usar orientação ecocardiográfica com contraste para visualização precisa dos locais alvo de injeção, reduzindo ao mínimo o risco de entrega acidental entre câmaras.

Antes de prosseguir com a injeção intramiocárdica, comece injetando uma combinação de cetamina e medetomidina para anestesiar o animal. Conforme demonstrado, o coelho permanece calmo quando a cabeça é coberta com um cobertor cirúrgico. Uma vez que o animal esteja anestesiado, use uma máquina de cortar cabelo para remover os pelos da pele do tórax, começando abaixo do pescoço e depois passando para a região subxifóide.

Raspe regiões adicionais de um a três centímetros da face interna do membro anterior direito, bem como as regiões tibiais mediais dos membros posteriores direito e esquerdo. Em seguida, aplique um gel condutor adequado nos eletrodos e posicione-os nas regiões raspadas dos membros. Fixe os eletrodos com fita cirúrgica para evitar a perda de contato durante a movimentação do animal durante o procedimento.

Em seguida, coloque o animal em um cobertor térmico, verifique se um sinal de ECG correto é exibido na tela do sistema, mantenha o animal em decúbito dorsal e permita que o animal respire espontaneamente enquanto administra oxigênio por máscara facial durante todo o procedimento. Limpe e desinfete completamente a pele raspada do peito com uma solução à base de clorexidina. Para manter um bom contato da pele com o transdutor e reduzir artefatos e melhorar a qualidade geral da imagem, aplique uma quantidade suficiente de gel de ultrassom no transdutor.

Em seguida, coloque manualmente o transdutor no quarto ao sexto espaço intercostal a dois a três centímetros de distância da linha paraesternal direita e em um ângulo de incidência do feixe de ultrassom de aproximadamente 90 graus, em relação à parede torácica. Certifique-se de que a marca de orientação do transdutor esteja voltada para a frente para facilitar seu alinhamento com a agulha nas etapas subsequentes. Você deve obter uma visão do eixo curto paraesternal do coração ao nível dos músculos papilares.

E é importante ter um amplo campo de visão, aumentando a profundidade com o controle adequado no sistema. Se necessário, ajustar a localização do transdutor em relação ao espaço intercostal, bem como seu ângulo ântero-posterior e dorsoventral para otimizar a imagem e, em seguida, identificar nesta incidência os músculos ventrículo direito, VD, ventrículo esquerdo, VE, septo interventricular, SIV, parede posterior, PW, bem como músculos papilares ântero e posteromedial. Preste atenção especial para obter uma imagem simétrica nesta visão, bem como a diferenciação apropriada das contorções endocárdicas e epicárdicas e, se necessário, ajustar por meio de controles de otimização de imagem, como controle de ganho.

Uma vez obtida a visão ecocardiográfica correta, mantenha essa posição durante todo o resto do procedimento enquanto um segundo operador realiza a injeção intramiocárdica. Para isso, use uma seringa pré-carregada com uma agulha acoplada que deve ser colocada perto da pele do hemitórax esquerdo em uma posição de espelhamento simétrica em relação ao transdutor. Em seguida, alinhe manualmente a agulha com a marca de orientação do transdutor em um ângulo de aproximadamente 90 graus e avance lentamente a agulha através da pele e na cavidade torácica.

A inserção percutânea da agulha nessa posição e orientação permite a visualização da agulha no plano do feixe de ultrassom, permitindo assim o monitoramento em tempo real e, quando necessário, o ajuste da localização da agulha em relação à região alvo do miocárdio, como mostrado aqui. Nota-se, nesta imagem, a presença da agulha na câmara ventricular esquerda, mostrada pelas pontas das setas. Isso pode ser facilmente reposicionado retraindo e reposicionando suavemente a agulha no local desejado.

Com a ponta no local alvo, administre lentamente o injetado por um período de 20 a 30 segundos, enquanto retrai lenta e suavemente a agulha para aumentar a extensão do miocárdio tratado. Realize mudanças sutis no ângulo de incidência da agulha conforme necessário para completar as injeções em quatro locais de injeção intramiocárdica. Um no septo intraventricular e três na parede livre do ventrículo esquerdo, e fornecem um volume de 250 microlitros de injetado por local de injeção.

Após a conclusão do procedimento, continue monitorando as varreduras ecocardiográficas da janela bisserial do coelho, bem como os traçados de ECG para verificar a ausência de complicações secundárias ao procedimento, até que o animal esteja totalmente acordado da anestesia. O uso de monitoramento de ECG Holter de 24 horas é aconselhável para ajudar a determinar os efeitos das injeções intramiocárdicas no ritmo cardíaco. Utilizando o protocolo aqui descrito, uma vez confirmado o posicionamento intramiocárdico da ponta da agulha por ecocardiografia e iniciada a injeção, observou-se hiperecogenicidade transmural durante a entrega de tinta nanquim na região alvo nesta incidência paraesternal de eixo curto, pontas de setas brancas.

A hiperecogenicidade também foi observada logo após a injeção, conforme mostrado nesta visão paraesternal de eixo longo do coração, onde uma imagem brilhante de eco pode ser vista claramente nas cabeças das setas brancas do septo interventricular. Quando a injeção intramiocárdica foi imediatamente seguida de eutanásia, depósitos de tinta nanquim eram facilmente visíveis no exame externo do coração, como mostrado nesta imagem. Pontas de seta pretas.

Da mesma forma, cortes de tecido cardíaco no nível dos músculos papilares revelaram depósitos transmurais de tinta nanquim na parede livre do ventrículo esquerdo, cabeças de setas pretas, demonstrando uma entrega eficiente e eficaz de injetado no miocárdio. Nesta mesma imagem, um depósito de tinta nanquim também era visível no septo interventricular. Seta branca.

Embora o procedimento tenha sido geralmente bem tolerado, foi muito comum observar aceleração ou desaceleração transitória da frequência cardíaca, associada a contrações ventriculares prematuras isoladas, PVC, tanto durante quanto logo após o procedimento. De fato, o monitoramento com Holter ECG de 24 horas em animais que receberam injeção intramiocárdica com tinta nanquim revelou que as arritmias eram muito comuns e que sua frequência relativa poderia ser afetada pelo estado fisiológico subjacente do animal. Esta imagem mostra um exemplo de PVC isolado, a arritmia mais frequentemente observada, detectada durante o Holter.

Uma comparação entre um grupo de coelhos com fenótipo normal e um grupo de coelhos que receberam administração intravenosa de doxorrubicina, ou DOX, uma droga cardiotóxica e contra o câncer, por oito semanas. Antes da injeção intramiocárdica com tinta nanquim indicou que os PVCs isolados foram significativamente mais frequentes no grupo DOX. Outras arritmias detectadas pelo Holter ECG em ambos os grupos foram dísticos de PVC, trigêmeos de PVC e taquicardia ventricular não sustentada.

Significativamente, enquanto a frequência cardíaca média nos grupos normal e DOX foi comparável, o desvio padrão do normal para normal, intervalos R para R ou SDNN, uma medida da dinâmica não linear relacionada ao estado de saúde do coração, exibiu uma redução acentuada no grupo tratado com doxorrubicina. Antes do procedimento, a transfecção bem-sucedida da proteína fluorescente verde aprimorada, células marcadas positivas para eGFP, foi confirmada por uma microscopia de fluorescência durante as condições de cultura de células in vitro. Então, após a injeção intramiocárdica, que foi imediatamente seguida de eutanásia, a entrega bem-sucedida de células marcadas positivas para eGFP no miocárdio foi demonstrada por meio de análise imuno-histoquímica de cortes de tecido cardíaco.

Assim, como mostrado nesta imagem, abundantes células marcadas estavam presentes no miocárdio. Pontas de setas pretas, intercaladas com depósitos de tinta nanquim. Depósitos de tinta nanquim e abundantes células positivas para eGFP, pontas de setas brancas, ainda estavam presentes quando a eutanásia foi adiada por 24 horas após a injeção intramiocárdica.

É importante notar que uma resposta inflamatória aguda foi observada neste momento, com neutrófilos infiltrando o miocárdio, setas vermelhas, sugerindo uma resposta aguda de rejeição celular às células xenogênicas que foram transplantadas. Inflamação aguda também foi observada 24 horas após a injeção intramiocárdica apenas com tinta nanquim. No entanto, neste caso, as células predominantes que infiltraram o miocárdio foram os macrófagos.

Pontas de seta brancas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma injeção intramiocárdica percutânea, guiada por ecocardiografia contrastada em um coração de coelho. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 25 minutos após a estase.