Os papéis de forças físicas no início Chick embrionárias morfogênese de sondagem

O objetivo geral deste protocolo experimental é estudar o papel das forças mecânicas no desenvolvimento inicial do cérebro embrionário por meio de experimentos ex ovo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento e na biomecânica, como os papéis das pistas mecânicas na morfogênese, que é a geração da forma biológica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a caracterização do papel das forças mecânicas na morfogênese no nível do tecido e do organismo.

Para iniciar este procedimento, use lenços delicados com 70% de etanol para limpar os ovos de galinha White Leghorn fertilizados e livres de patógenos específicos. Em seguida, arrume os ovos em uma orientação longitudinal em um suporte. Depois disso, defina a incubadora de ovos a uma temperatura alvo de 37,5 graus Celsius e mantenha a umidade em 48 a 55%A umidade é controlada adicionando uma quantidade adequada de água à incubadora.

Incubar os ovos por aproximadamente 40 a 44 horas até HH11 a 13. Depois, deixe os ovos esfriarem em temperatura ambiente por aproximadamente 15 a 30 minutos antes de limpar com etanol a 70%. Nesta etapa, quebre os ovos do fundo, separe a casca com cuidado e deposite cuidadosamente o conteúdo em uma placa de Petri de 150 por 15 milímetros.

Para garantir que o lado do embrião esteja para cima, mantenha os ovos na mesma orientação em que foram incubados enquanto os quebra. Remova a albumina fina usando uma pipeta Pasteur descartável. Separe a albumina espessa da gema usando a pinça de ponta romba.

Certifique-se de que a albumina espessa foi removida raspando levemente a parte superior da gema. Em seguida, usando uma pinça de ponta fina, coloque um anel de papel de filtro sobre o embrião e centralize-o, combinando o eixo longo do anel com o eixo longo do embrião. Em seguida, corte a gema ao redor do anel de papel de filtro com uma tesoura.

Em seguida, puxe o anel e o embrião da gema em uma direção oblíqua em direção ao local onde a gema foi cortada pela primeira vez. Em seguida, enxágue o embrião em dois pratos sequenciais de 100 milímetros com PBS em temperatura ambiente. Em seguida, coloque um anel de papel de filtro em uma placa de Petri de 35 milímetros.

Coloque o lado dorsal do embrião para cima no outro papel de filtro na placa de Petri de 35 milímetros. Depois disso, coloque um anel de aço inoxidável em cima do sanduíche de papel de filtro. Tome cuidado para não danificar o embrião.

Agora, adicione três mililitros do CCM previamente preparado a cada placa de Petri. Remova a membrana vitelina de cada embrião deslizando levemente a agulha capilar puxada pela parte superior do embrião. Em seguida, retire a membrana vitelina, começando pela extremidade anterior e prosseguindo para a notocorda.

Em seguida, coloque oito placas de Petri de 35 milímetros em uma placa de 150 milímetros forrada com lenços saturados de água para manter a umidade. Em seguida, coloque a placa de Petri de 150 milímetros em um saco plástico lacrado e encha o saco com uma mistura de gases composta por 95% de oxigênio e 5% de CO2. Feche o saco e coloque-o em uma incubadora de 37,5 graus Celsius.

Agora, remova o embrião da incubadora e use um sistema OCT para obter imagens e determinar o ângulo de torção do tubo neural. Transfira os embriões para um microscópio óptico e visualize com ampliação de 10X. Use uma pipeta de 200 microlitros para remover incrementalmente 0,2 mililitros de mídia da placa de Petri.

Tire imagens de campo claro após cada rodada de remoção de mídia para observar o efeito da interface mídia-ar no embrião. Continue removendo o meio até que a tensão superficial no embrião induza a torção. Fotografe o embrião usando o sistema OCT mais uma vez para estabelecer um ângulo de torção final para comparação com embriões de controle.

Para alterar a direção da alça do coração, use uma pinça para virar o papel de filtro para que o embrião fique com o lado ventral para cima. Em seguida, use o tubo capilar puxado para abrir uma fenda na membrana esplâncnopleura e exercer uma força mecânica para empurrar o coração do lado direito para o lado esquerdo. Aplique a tensão superficial do fluido para manter o coração do lado esquerdo.

Em seguida, incube o embrião por mais 20 horas para ver a mudança na quiralidade da torção. Aqui é mostrado um embrião colhido com VM removido em HH11. O mesmo embrião incubado por 27 horas após a remoção do VM mostrando torção reduzida.

Aqui está o mesmo embrião que sofreu torção cerebral após a aplicação de tensão superficial do fluido, e aqui está o embrião de controle com torção cerebral normal em um estágio comparável. Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado para não danificar o embrião. Seguindo este procedimento, outros métodos, como a análise de elementos finitos, podem ser realizados para modelar computacionalmente como as forças físicas podem influenciar a morfologia.

Portanto, esta técnica desenvolvida aqui abriu caminho para futuros estudos sobre a mecânica da morfogênese em embriões de galinhas. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como colher embriões de galinha para cultura in vitro, remover microcirurgicamente a membrana vitelina, recapitular a força fornecida pela membrana vitelina e monitorar a morfologia embrionária por meio de OCT e imagens de campo claro.