Подготовка дрозофилы личиночной образцов для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ МС)-на основе Метаболомика

Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области метаболизма, например, как онкометаболит L2-гидроксиглутарат синтезируется в здоровых клетках. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет пользователю напрямую измерять более 100 метаболитов чувствительным и воспроизводимым способом. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что протокол требует эффективной обработки образцов и чрезвычайно чувствителен к водяному пару.

Для начала протокола добавьте один миллилитр ледяного 0,9% хлорида натрия в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую заранее подготовленные личинки. Закройте крышку, вертикально переверните трубку, чтобы тщательно промыть личинок, и поместите трубку на лед на 30 секунд. Личинки опустятся на дно трубки, а дрожжи останутся во взвешенном состоянии.

Как только все личинки сформируют рыхлую гранулу, удалите раствор хлорида натрия с помощью пипетки объемом в один миллилитр. Центрифугируйте образцы при температуре 2000 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Удалите весь остаточный раствор с помощью пипетки объемом 200 микролитров и немедленно заморозьте образец в жидком азоте.

Используйте непроницаемый для этанола маркер для маркировки боковой стороны двухмиллилитровой трубки с завинчивающейся крышкой. Далее измерьте массу пробирки с маркированным шариком с помощью аналитических весов, способных с точностью измерить 0,01 миллиграмма. С помощью длинных щипцов извлеките 1,5-миллилитровую пробирку с образцом из жидкого азота Дьюара.

Надев нитриловые перчатки, возьмите замороженную трубку, переверните ее и резко ударьте крышкой трубки о столешницу, чтобы выбить замороженную гранулу. Сразу же вылейте гранулу в предварительно затаренную двухмиллилитровую трубку с завинчивающейся крышкой. Образец должен быть быстро обработан, чтобы гарантировать, что эндогенные метаболические пути не будут реактивированы.

Быстро измерьте общую массу гранулы личинки и трубки с шариками. Немедленно поместите пробирку с образцом в жидкий азот. Поместите пробирки с образцами в настольный охладитель с температурой минус 20 градусов Цельсия.

Добавьте в каждую пробирку 0,8 миллилитра предварительно охлажденного 90% метанола, содержащего два микрограмма на миллилитр янтарной кислоты D4. Верните образцы в настольный охладитель с отрицательным температурой 20 градусов Цельсия. Установите отрицательный контроль, добавив 0,8 миллилитра предварительно охлажденного 90%-ного метанола, содержащего два микрограмма на миллилитр янтарной кислоты D4, в пустую трубку с шариками.

Затем гомогенизируйте образцы в течение 30 секунд со скоростью 6,45 метра в секунду с помощью гомогенизатора бисерной мельницы, расположенного в комнате с температурой 4 градуса Цельсия. Верните гомогенизированные образцы в настольный охладитель с отрицательным температурой 20 градусов Цельсия и переведите охладитель в морозильную камеру с отрицательным температурой 20 градусов Цельсия не менее чем на один час. После инкубации центрифугируйте пробирки при температуре 20 000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для удаления образовавшегося осадка.

Перелейте 600 микролитров надосадочной жидкости в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, и не тревожьте осадок. Откройте все пробирки с образцами и поместите их в вакуумную центрифугу. Высушите образцы при комнатной температуре до тех пор, пока не будет удален весь растворитель.

Если высушенные образцы хранились при температуре минус 80 градусов Цельсия, поместите неоткрытые пробирки с образцами в вакуумную центрифугу и высушите их в течение 30 минут. Приготовьте раствор из 40 миллиграммов на миллилитр метоксиламина гидрохлорида, или МОКС, в безводном пиридине. Храните МОКС и пиридин в эксикаторе.

Затем с помощью теплового пистолета высушите стеклянный шприц объемом один миллилитр в течение примерно пяти секунд. Введите иглу шприца во флакон с безводным пиридином. Удалите один миллилитр пиридина и добавьте его в микрофуговую пробирку, содержащую 40 миллиграммов МОКС.

Эта часть протокола чрезвычайно чувствительна к воде. Перед использованием все реагенты должны храниться в эксикаторе. Кроме того, пользователь должен убедиться, что образец имеет минимальное воздействие атмосферного водяного пара.

Затем промойте бутылку с безводным пиридином с аргоном. Закройте флакон и верните его в эксикатор. Растворите МОКС в пиридине, инкубируя пробирку в термомиксере при температуре 35 градусов Цельсия в течение 10 минут при 600 оборотах в минуту.

Далее добавьте в высушенный образец 40 микролитров по 40 миллиграмм на миллилитр МОКС-кислот в безводном растворе пиридина. Ввергните образец в вихрь в течение 10 секунд и кратковременно центрифугируйте его. Затем инкубируйте образец в термомиксере.

Центрифугируйте образец при максимальной скорости 20 000 g или в течение пяти минут, чтобы удалить частицы. Переложите 25 микролитров надосадочной жидкости во флакон автосамплера с помощью вкладыша объемом 250 микролитров из деактивированного стекла. Добавьте 40 микролитров MSTFA, содержащего 1% TMCS.

Наденьте крышку на флакон автосамплера и закройте флакон с помощью обжимного инструмента. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа с встряхиванием при 250 оборотах в минуту. Наконец, добавьте три микролитра ранее приготовленного стандартного метилового эфира жирных кислот (FAMES) во флакон автосамплера с помощью роботизированного автосамплера непосредственно перед инъекцией.

Газовая хромато-масс-спектрометрия мутантных личинок лактатдегидрогеназы демонстрируют значительные изменения лактата, пирувата и L2-гидроксиглутарата по сравнению с контрольными личинками. Спектры GC-MS, сгенерированные с помощью протокола, демонстрируют множество видимых особенностей и заметный пик для трегалозы, который обычно представляет собой самый большой пик в образце личинок. Анализ принципиальных компонент, или PCA, ясно показывает, что группы нокаутного и дикого типов отделяются друг от друга и что ни в одной из этих групп нет выбросов.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что образцы должны быть заморожены до гомогенизации и чтобы все реагенты оставались сухими на протяжении всей процедуры.