Thérapie génique inspiré Polycation enduit pour la Protection de l’ADN Origami Nanostructures

La stabilisation biologique des nanostructures d’ADN est essentielle pour les futures applications in vivo, telles que l’administration ciblée de médicaments. Cependant, l’ADN se dégrade dans le corps par diverses enzymes. Nous présentons ici une technique de revêtement qui protège les nanostructures d’ADN contre la dégradation enzymatique.

Les principaux avantages sont que notre revêtement comprend des composés non toxiques qui sont déjà utilisés dans les organismes vivants et que la fonctionnalisation de la surface reste possible. Cette fonctionnalisation est importante pour intégrer des capteurs moléculaires pour la reconnaissance des cibles et des commutateurs pour la libération de cargaison de drogue. Les revêtements de polycation augmentent considérablement l’absorption cellulaire des structures encapsulées d’origami d’ADN, ainsi cette méthode peut ouvrir la porte aux applications de l’origamis d’ADN dans les diagnostics et les thérapeutiques.

L’absorption cellulaire est également nécessaire pour les applications potentielles de livraison de gènes de la nanotechnologie de l’ADN. Je considère que la méthode est assez simple et peut être facilement maîtrisée. Pour commencer, mesurer la concentration d’origami ADN purifié.

Utilisez deux microlitres de tampon antituberculeux comme blanc pour calibrer le spectrophotomètre ultraviolet. Et ensuite mesurer la concentration d’origami d’ADN à 260 nanomètres. Calculez ensuite les quantités de phosphates dans la solution origami purifiée de l’ADN, à l’aide de la formule deux, tel que décrit dans le manuscrit.

Préparez 15 microlitres de la structure origami de l’ADN en incluant une nanomole de phosphate, en utilisant le tampon antituberculeux pour la dilution. Ajouter 13,2 microlitres à la tuberculose à 1,8 microlitre de chitosan. Et ajouter 15 microlitres de la solution chitosan à 15 microlitres de l’origami ADN pour développer un polyplex chitosan origami ADN avec un rapport N / P de huit.

Continuez à préparer des polyplex de différents ratios N/P, en utilisant les calculs décrits dans le manuscrit. Préparer 80 millimètres d’un tube pour 2% de gel agarose. Ajouter 352 microlitres de chlorure de magnésium molaire de 2,5 molaires, puis pré-tacher avec 10 microlitres de tache de gel d’ADN.

Verser la solution de gel dans une boîte de gel sec. Insérez un peigne d’électrophoresis de gel et laissez-le solidifier à température ambiante pendant 15 à 30 minutes. Pendant ce temps, compléter le tampon en cours d’exécution avec du chlorure de magnésium de 11 millimlaires.

Mélanger 10 à 20 microlitres de chaque échantillon avec 20 % du tampon de chargement 6X. Chargez les échantillons dans les puits de gel agarose, y compris un origami ADN nu comme contrôle. Faire fonctionner le gel à 70 volts à température ambiante pendant deux heures et demie à trois heures.

Ensuite, utilisez un scanner UV pour visualiser le gel. Pour effectuer un test de protection DNase I, ajouter quatre microlitres de chaque polyplex par rapport à différents rapports N / P, 1,5 microlitres de 10X DNase I tampon, 8 microlitres de tb, et 1,5 microlitres de DNase I à un tube PCR séparé de 2 millilitres. Puis incuber la même chose à 37 degrés Celsius dans un thermocycler pendant 24 heures.

Pour digérer le DNase I, ajouter deux microlitres de 20 milligrammes par millilitres proteinase K et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un thermocycler. Ensuite, pour démêler les nanostructures d’ADN de base ajouter 3,6 microlitres de 50 milligrammes par millilitre 40 kilodaltons dextran sulfate. Ensuite, utilisez ces échantillons et origami ADN frais comme contrôle pour effectuer l’électrophoresis gel agarose comme décrit précédemment.

Exciser la bande correspondant à des échantillons chargés du gel. Pour extraire l’origami d’ADN, utilisez une colonne d’extraction de gel de compression et suivez les instructions du fabricant et continuez avec l’imagerie électronique négative de microscopie de transmission de tache comme décrit dans le manuscrit. Mélanger 6,5 microlitres de HRP-NR purifié de 36 nanomolaires avec 6,5 microlitres de polycations de concentrations variables.

Pour préparer un polyplex à n/p ratios d’un, deux, quatre, 10 et 20, préparer un groupe vierge en mélangeant 6,5 microlitres d’eau distillée avec 6,5 microlitres de polycations de différentes concentrations correspondant aux ratios N/P d’un, deux, quatre, 10 et 20. Ajoutez ensuite 12,5 microlitres de chacune de ces solutions préparées à un puits séparé d’une plaque de puits 96. Ajouter ensuite 72,5 microlitres de tampon HEPES à chaque puits et mélanger.

Ajouter 10 microlitres de 15 milli molaires ABTS, puis 5 microlitres d’un peroxyde d’hydrogène de 12 millimlaires à chaque puits et mélanger en pipetting de haut en bas. Enfin, utilisez un lecteur de plaques multimodes pour mesurer l’absorption à 421 nanomètres sur quatre heures. Après avoir analysé les polyplex à l’aide d’un essai de retard de gel, il y a eu un déplacement de la nanostructure nue vers la cathode, probablement en raison du contrepoids de la charge négative des groupes de phosphate lors de la liaison aux polycations, et de l’augmentation de taille du complexe.

Quand une quantité supplémentaire de polyanions, telles que le sulfate dextran, a été ajoutée, la formation de polyplex a été inversée. Le sulfate de Dextran d’un poids moléculaire plus élevé s’est révélé plus efficace que le poids moléculaire inférieur. Après avoir analysé les polyplex à l’aide d’une microscopie électronique négative de transmission des taches, les micrographes ont montré des nanostructures nues d’origami d’ADN, des polyplex linéaires de polyethylenimine après la décapsulation, des polyplex chitosan, des images d’origami nu et protégé d’ADN soumis à l’épuisement de magnésium, à la dégradation enzymatique, et à la digestion de sérum.

En présence de DNase I, après deux heures, les nanostructures nues ont été complètement digérées, tandis que les polyplex linéaires de polyethylenimine de chitosan encapsulés origami adn sont restés intacts en présence de 10 unités par millilitre DNase I.Linear polyethylenimine polyplexes protéger les nanostructures d’ADN plus efficacement par rapport au chitosan. Lorsque le rapport N/P du polyplex est augmenté, la digestion de l’ADN était plus faible. Après l’enzyme de revêtement, ou après origami plus fonctionnel d’ADN, avec les polyplex linéaires de polyethylenimine et le chitosan aux rapports de variante de N/P, aucune interférence remarquable avec l’activité enzymatique n’a été observée.

D’autre part, le cinétique de l’enzyme HRP radicalement changé après la liaison à l’origami ADN. Il est important de commencer par des structures origami adn bien purifiées. Il existe un brin plus stable qui peut également se lier à des polycations.

Ils sont difficiles à séparer des polyplex origami de l’ADN. Nos molécules de revêtement sont également utilisées dans les applications de thérapie génique. Cela signifie que les nanostructures d’ADN peuvent être utilisées à l’avenir pour modifier le génome des organismes vivants.

Pour la coloration du gel agarose, habituellement des molécules sont utilisées qui intercalent l’ADN et sont potentiellement mutagènes. Veuillez suivre les consignes de sécurité de votre laboratoire lors de la coloration de l’ADN.