Efecto De Las Formulaciones Artificiales De Lágrima En La Actividad Metabólica De Las Células Epiteliales Corneales Humanas Después De La Exposición A La Desecación

El propósito de este protocolo es evaluar en un modelo in vitro si las formulaciones de lágrimas artificiales pueden proteger las células epiteliales de la córnea humana de la desecación. Este método se puede utilizar para ayudar a identificar formulaciones de ojo seco que pueden ayudar en la protección ocular de las personas con síntomas de ojo seco. Este ensayo utiliza una medida muy sensible para detectar la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea.

Como resultado, se pueden detectar pequeños cambios en la salud de las células corneales debido a la desecación. Las que demostrarán el procedimiento hoy serán Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran y Adeline Suko. Comience cultivando células epiteliales de la córnea humana inmortalizadas en frascos recubiertos de colágeno con 20 mililitros de DMEM/F12 que contengan un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, cambiando los medios cada dos o tres días.

Una vez que las células estén casi confluentes, retire el medio de cultivo celular y agregue de cuatro a seis mililitros de medio de disociación celular a cada matraz. Incubar las células a 37 grados centígrados hasta que se desprendan, revisándolas periódicamente bajo el microscopio. Agregue de dos a seis mililitros de DMEM/F12 con 10% de FBS a cada matraz y transfiera el contenido a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Centrifugar las células a 450 a 500 veces g durante cinco minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en medios precalentados. Determine la concentración de células con un hemocitómetro y calcule el volumen que contiene 100.000 células.

Agregue medios a cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno I de 48 pocillos, junto con el volumen calculado de células, asegurándose de que el volumen final en cada pocillo sea de 0,5 mililitros. A continuación, incubar las células durante 24 horas. Para el procedimiento de control, retire los medios de cultivo de los pocillos y trate inmediatamente las células con 150 microlitros de una formulación de prueba o solución de control de medios.

A continuación, incubar las células durante 30 minutos. Retire la solución de prueba de las células y agregue 0,5 mililitros de solución de colorante metabólico al 10%. Incuba las células durante otras cuatro horas.

Después de la incubación, retire 100 microlitros de solución de tinte de cada pocillo y transfiérala a una placa de 96 pocillos. Utilice un lector de placas para medir la fluorescencia de cada pocillo, ajustando la excitación a 540 nanómetros y la emisión a 590 nanómetros. Para llevar a cabo el procedimiento de recuperación, incube las células con las soluciones de prueba o controles como se ha descrito anteriormente.

A continuación, añada 0,5 mililitros de medio DMEM/F12 a cada pocillo. Incubar las células durante 18 horas. A continuación, retire el medio y pruebe la actividad metabólica.

Para realizar el procedimiento de control, retire los medios de cultivo de las células en la placa de 48 pocillos y trátelos inmediatamente con la formulación de prueba o la solución de control de medios. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Después de la incubación, retire las soluciones de prueba de las celdas y colóquelas en una cámara de 37 grados centígrados y 45% de humedad durante cinco minutos para que se sequen.

A continuación, agregue 0,5 mililitros de solución de colorante metabólico al 10% e incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, transfiera 100 microlitros de la solución de colorante metabólico de cada pocillo a una placa de 96 pocillos y mida la fluorescencia. Para realizar el procedimiento de recuperación, repita el protocolo descrito anteriormente e incluya una incubación de 18 horas con medio DMEM/F12 después de la etapa de desecación.

A continuación, realice un análisis estadístico de los datos tal y como se describe en el manuscrito del texto. Se compararon tres formulaciones de ojo seco por su efecto sobre la viabilidad de las células epiteliales de la córnea humana. Las soluciones uno y dos tuvieron un efecto significativo sobre la actividad metabólica de las células antes de la desecación.

Las células expuestas a la solución uno mostraron una caída adicional en la actividad metabólica celular después de una recuperación de 18 horas, lo que significa que inicialmente se lesionaron y la lesión no se reparó. En comparación, la solución tres solo tuvo un efecto leve sobre la actividad metabólica de las células epiteliales. Al comparar la capacidad de estas formulaciones de ojo seco que contienen lípidos para proteger las células, se encontró que las soluciones uno y dos no protegían a las células del estrés por desecación.

La solución tres, sin embargo, ofrecía cierta protección. Al sembrar las células en placas recubiertas de colágeno, asegúrese de que la suspensión celular contenga células que se mezclen uniformemente para que cada pocillo se siembre con el mismo número de células. La solución tres demostró una mejora estadísticamente significativa en la viabilidad celular y la protección contra el estrés de desecación en comparación con los otros dos productos que contienen lípidos.

Es posible que el aceite mineral con fosfolípidos, junto con HP-guar y propilenglicol, permitan que la solución tres brinde protección de hidratación a las células de la córnea y reduzca la evaporación bajo desecación.