Isolement de liquides proximaux pour étudier le microenvironnement tumoral de l’adénocarcinome pancréatique

La méthode décrite ici pour isoler le liquide proximal chez l’homme et chez la souris peut être appliquée à l’étude du microenvironnement du cancer du pancréas afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs de la maladie. En utilisant ce protocole simple, il est possible de traduire les résultats cliniques du suc pancréatique en modèles murins de PDAC pour effectuer des études mécanistes. Le suc pancréatique est un liquide corporel largement inexploré qui s’est avéré prometteur en tant que source de biomarqueurs précieux pour aider au diagnostic préopératoire et au profilage des patients.

Je ferai la démonstration de la première partie du protocole, et Marialuisa Barbagallo, postdoc de notre laboratoire, fera la démonstration de la deuxième partie du protocole. Estimez l’emplacement du canal pancréatique à l’aide des mesures acquises lors de l’imagerie. Palpez ensuite la surface antérieure du pancréas pour identifier son emplacement précis.

Tenez la tête pancréatique dans le duodénum par le dessous et élevez-la avec la main gauche, en marquant l’emplacement du canal pancréatique avec le premier doigt. Utilisez la main droite pour insérer une seringue de trois millilitres avec une aiguille de calibre 25 dans le pancréas, juste distale par rapport au pouce gauche. Décidez de la profondeur de pénétration et du degré d’inclinaison de l’aiguille en fonction des mesures préopératoires et de la perception d’avoir pénétré la paroi du conduit.

Retirez le jus à l’aide de la seringue. S’il n’est pas possible de récupérer le jus, déplacez l’aiguille pour tenter de canuler le canal pancréatique. Une fois que le suc pancréatique est récupéré, déplacez-le à l’extérieur du champ stérile et transférez-le dans un tube à essai sous vide EDTA de trois millilitres.

Maintenez le tube à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’échantillon soit transféré au laboratoire. Pour traiter le suc pancréatique, centrifugez-le à 400 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer toutes les cellules ou débris. Récupérez le surnageant, aliquotez-le et stockez-le à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que des analyses plus approfondies soient effectuées.

Pour isoler le liquide interstitiel tumoral ou TIF, par centrifugation, coupez la tumeur en deux, rincez les deux parties dans du PBS et épongez-les doucement sur du papier filtre, en vous déplaçant aussi vite que possible pour éviter l’évaporation de la tumeur. Transférez immédiatement la tumeur dans une passoire à cellules en nylon de 20 micromètres, fixée à un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez le tube à 400 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Récupérez le TIF au fond du tube, puis aliquotez-le et congelez-le immédiatement sur de la glace sèche. Conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Pour isoler le TIF à l’aide de l’élution, coupez la tumeur en petits morceaux avec des ciseaux ou un scalpel et rincez-les soigneusement avec du PBS froid.

Transférez les morceaux de tumeur dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 500 microlitres de PBS avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase pour éviter la dégradation des analytes. Incuber le tissu pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et effectuez une série d’étapes de centrifugation à quatre degrés Celsius pour retirer toutes les cellules de l’échantillon.

Récupération du surnageant après chaque centrifugation et transfert dans un nouveau tube. Après la dernière centrifugation, aliquote et congélation immédiates de l’échantillon TIF sur de la glace carbonique. Conservez-le à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie.

Ce protocole a été utilisé pour obtenir le suc pancréatique de patients atteints de PDAC et d’autres affections pancréatiques bénignes. Après avoir filtré les signaux RMN larges des macromolécules, les signaux des métabolites de faible poids moléculaire étaient apparents. L’analyse OPLS-DA supervisée a montré que le profil métabolique du suc pancréatique était capable de faire la distinction entre les patients PDAC et les patients non PDAC avec une précision de 82,4 %.

Pour démontrer que le contenu du liquide interstitiel tumoral reflète de manière fiable les changements dans le microenvironnement tumoral, deux lignées cellulaires de cancer du pancréas avec des taux glycolytiques opposés ont été injectées par voie sous-cutanée à des souris. Après l’excision des tumeurs, les concentrations de glucose et de lactate ont été quantifiées. Le liquide interstitiel tumoral des tumeurs hautement glycolytiques contenait moins de glucose et plus de lactate par rapport aux tumeurs à faible glycolyse.

Dans cette étude, nous avons effectué une analyse métabolomique. Cependant, ces fluides proximaux conviennent à de nombreuses autres applications en aval, telles que la spectrométrie de masse et le profilage des microARN.