تصنيع بلوري Nanocellulose جزءا لا يتجزأ من الحبر Agarose المواد الحيوية لثقافة الخلايا الصاري نخاع العظام المستمدة

يوفر هذا البروتوكول نهجا سهلا وسريعا لفحص أحبار المواد الحيوية المرشحة للآثار السامة للخلايا المحتملة ضد الخلايا الأولية والمناعية الحساسة قبل تجارب الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المعقدة. بعد احتضان الخلايا المناعية على بنيات الحبر المواد الحيوية، يمكن استرجاع الخلايا بسهولة من البنى عن طريق غسل لطيف لإجراء السمية الخلوية المصب أو تحليلات العلامات الحيوية. هذا البروتوكول هو ذات الصلة مباشرة لهندسة الأنسجة التي يجب أن تبنى الأنسجة المطبوعة بيولوجيا التي هي متجهة لزرع من الخلايا الأولية وحبر المواد الحيوية المتوافقة بيولوجيا.

للبدء، قم بإعداد خرطوشة حبر حيوي لتركيبها على الطابعة الحيوية INKREDIBLE+3D. أولا، قم بإزالة قبعات النهاية الزرقاء من خرطوشة حبر المواد الحيوية ثلاثية الملليلتر وألصق فوهة طباعة بيولوجية مخروطية معقمة من عيار 22 إلى نهاية قفل Luer لخرطوشة الحبر الحيوي. قم بتوصيل أنابيب إمداد ضغط الهواء لرأس الطباعة واحد أو PH1 بالطرف المقابل للخرطوشة وأدخل الخرطوشة مع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المرفقة في الفتحة الرأسية ل PH1.

بعد ذلك، قم بمقعد الخرطوشة بقوة في PH1 مع فوهة طباعة بيولوجية مخروطية تمتد أسفل رأس الطباعة. شد المسمار على PH1 في اتجاه عقارب الساعة حتى إصبع ضيق لقفل خرطوشة الحبر الحيوي في مكان. لاحظ أنه يمكن إجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد مع ترك PH2 فارغا.

الطاقة على الطابعة الحيوية وإطلاق برنامج الطباعة الحيوية على جهاز كمبيوتر متصل بالطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد عبر كابل USB 2.0. في البرنامج، انقر فوق زر الاتصال لمزامنته مع الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد. لاحظ ثلاثة خيارات في قائمة التحكم الرئيسية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.

أولا، إعداد الطباعة الحيوية. ثانيا، قائمة المرافق. وثالثا، شاشة الحالة.

حدد خيار التحضير للطباعة الحيوية، ثم مرر لأسفل إلى خيار محاور المنزل وحدده. بعد المعايرة الناجحة لمحاور XYZ، سينخفض ارتفاع سرير الطباعة قليلا وستنتقل رؤوس الطباعة إلى أعلى النقطة المركزية لسرير الطباعة. للشروع في معايرة نقطة البداية للطباعة الحيوية في لوحات 24 بئرا ، قم بإزالة لوحة ثقافة معقمة من 24 بئرا من غلافها البلاستيكي المختوم ووضع علامة على نقطة مركزية من البئر D1 على الجانب السفلي من اللوحة مع علامة دائمة.

قم بإزالة غطاء اللوحة ووضع لوحة الثقافة ذات ال 24 بئرا على سرير الطباعة مع D1 جيدا الموجود في الزاوية اليسرى الأمامية من سرير الطباعة. في قائمة التحكم الرئيسية، حدد قائمة الأدوات المساعدة ثم قم بنقل المحور. حرك رؤوس الطباعة بزيادات ملليمتر واحد على طول محاور X و Y حتى تكون فوهة الطباعة الحيوية المخروطية ل PH1 فوق النقطة التي تم وضع علامة عليها تحت D1 بشكل جيد. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية فوق النقطة عن طريق تحريك رؤوس الطباعة بزيادات 0.1 ملليمتر.

سجل احداثيات X و Y من فوهة الطباعة الحيوية المخروطية عندما مباشرة فوق مركز D1 جيدا كما هو مبين في شاشة لوحة التحكم للطباعة الحيوية 3D ووضع علامة أسفل الإحداثيات. بعد ذلك ، ارفع سرير الطباعة بزيادات ملليمتر واحد حتى يقوم الجزء السفلي من البئر D1 بلمس فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المثبتة في رأس الطباعة الأول. ضبط حركة السرير المطبوع بزيادات 0.1 ملليمتر إذا لزم الأمر.

من قائمة المرافق، حدد خيار معايرة المحور Z وحدد خيار معايرة Z في المتجر وتأكد منه. العودة إلى القائمة الرئيسية وحدد الخيار إعداد الطباعة الحيوية. مرر لأسفل إلى وحدد خيار معايرة Z.

تحديث رمز هندسي لوحة 24 جيدا أو G-رمز مع إحداثيات نقطة البداية الصحيح. افتح ملف G-code المتوفر 24 جيدا على برنامج الطباعة الحيوية. تحديث إحداثيات س و ص على سطر واحد مع القيم التي تم الحصول عليها في الخطوات السابقة وحفظ الملف تحت اسم جديد.

تأكد من أن المضخة الهوائية متصلة بإحكام بمنفذ كمية الهواء الخلفي للطباعة الحيوية INKREDIBLE+ 3D ثم قم بتشغيلها. اسحب مقبض التحكم الأمامي الموجود على الجانب الأيمن من الطابعة الحيوية INKREDIBLE+3D. تأكد من أن مقاييس الضغط الرقمي لPH1 و PH2 الموجودة على الجزء الأمامي من الطابعة الحيوية كل قراءة ما يقرب من صفر كيلوباسكال.

تدوير مقبض التحكم إلى الأمام ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى يصل الضغط المشار إليه على المقياس الأيسر ل PH1 إلى 12 كيلوباسكال. ضع ورق نسيج مطوي أو قطعة من فيلم الختم المقاوم للماء تحت فوهة الطباعة للخرطوشة المثبتة، مع الحرص على عدم لمس فوهة الطباعة. من قائمة التحكم الرئيسية على الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، حدد إعداد الطباعة الحيوية.

انتقل إلى وحدد تشغيل PH1. لاحظ أن الحبر الحيوي يبدأ في البثق من فوهة الطباعة. إذا لزم الأمر، قم بزيادة ضغط البثق عن طريق تدوير مقبض التحكم في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم قذف الحبر الحيوي في خيوط مستمرة وتسجيل إعداد الضغط الجديد.

حدد إيقاف تشغيل PH1 لإيقاف البثق للحبر الحيوي. قم بإزالة ورق الأنسجة أو الفيلم الذي يحتوي على الحبر الحيوي مقذوف من سرير الطباعة وإغلاق باب الطابعة الحيوية. لإجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للركائز الهيدروجيل المستقيمة في شكل لوحة 24 جيدا ، حدد قائمة المرافق من قائمة التحكم الرئيسية ، ثم حدد تعطيل طباعة SD التي ستسمح لبرنامج الطباعة الحيوية بنقل ملفات G-code إلى الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للطباعة.

انقر على زر التحميل في برنامج الطباعة الحيوية وحدد ملف G-code المحدث ذو 24 بئرا. في لوحة التحكم اليمنى في البرنامج، حدد علامة التبويب معاينة الطباعة وانقر على زر الطباعة لبدء الطباعة الحيوية في D1 جيدا. عند الانتهاء من الطباعة الحيوية للبنى المستقيمة ، قم بتغطية اللوحة ذات ال 24 بئرا بغطاءها ونقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية. تزج كل بناء المستقيم في قطرتين من المعقمة 50 ملليمولار محلول كلوريد الكالسيوم واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

يستنشق بعناية محلول كلوريد الكالسيوم من كل بئر بناء وشطف مرة واحدة في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني 1X لإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد. لمنع الجفاف من يبني الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا، والحفاظ على 3D يبني المستقيم المطبوع بيولوجيا في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة حتى خلايا الصاري المشتقة من نخاع العظام على استعداد لتكون البذور على البنى. واستنادا إلى معلمات التشتت الأمامي والجانبي للمركبات ثنائية الميثاز التي تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي، لوحظ أن ركيزة الهيدروجيل ذات أعلى تركيز CNC لم تغير الحجم الأصلي أو التفاصيل الأصلية ل BMMCs بالمقارنة مع BMMCs المستزرعة في غياب ركائز الهيدروجيل D-mannitol AGAROSE D-mannitol.

وأظهر تحليل التدفق الخلوي نفاذية BMMCs إلى يوديد البروبيديوم أن أيا من تركيزات CNC التي تم اختبارها لم يثر أي تأثير سلبي على قابلية BMMC للحياة. زادت ركيزة CNC agarose من التعبير عن المؤشرات الحيوية للخلايا السارية بتركيزات CNC أكبر من أو تساوي 2.5٪ ومع ذلك ، ظلت مستويات التعبير لهذه المستقبلات متسقة نسبيا بين 2.5٪ و 12.5٪ CNC مما يشير إلى تأثير مستقل عن تركيز CNC. أظهر فحص XTT أن النشاط الأيضي ل BMMCs المستزرعة على سقالات الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد ظل ثابتا نسبيا عند حوالي 100٪ عبر جميع النقاط الزمنية المختبرة.

وبالمثل، لم يكشف الإصدار LDH ومقاييس استبعاد صبغة PI عن أي تغييرات كبيرة في جدوى BMMCs. الاهتمام الدقيق باختيار مقياس فوهة الطباعة، ومعايرة محاور الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، وإعداد ضغط البثق سيضمن الطباعة القابلة للاستنساخ للبنى ثلاثية الأبعاد عالية الجودة. السهولة التي يمكن استرجاع الخلايا الصاري يسمح لهم أن يتم التحقيق من قبل مجموعة واسعة من المقايسات البيولوجية لمزيد من الدراسة أي جانب من جوانب وظائفها الخلوية.