Generazione di espianti di blastoderma naïve da embrioni di zebrafish

Anche gli embrioni molto precoci contengono molte molecole di segnalazione diverse, il che può rendere difficile discernere la completa funzione di ogni singolo segnale embrionale. Isolando le cellule dai centri di segnalazione endogeni, questi espianti consentono ai ricercatori di esaminare il ruolo di una data molecola di segnalazione in relativo isolamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di ricapitolare i tempi embrionali, i movimenti cellulari e i modelli di espressione genica all'interno di un sistema ex-vivo semplificato senza il tempo o lo sforzo necessari per mantenere le cellule staminali in coltura.

Inizia tagliando prima gli espianti dagli embrioni non infetti. Se gli espianti estendono la cultura, il taglio è stato fatto per chiudere il tuorlo. Inizia riempiendo un ago capillare di vetro tirato con RNA.

Posizionare l'ago riempito in un micropolatore e rompere la punta dell'ago con la pinna. Calibrare il volume di iniezione utilizzando un micrometro di stadio con una goccia di olio minerale, regolando il tempo di iniezione e la pressione sull'iniettore pneumatico per ottenere un bolo della dimensione desiderata. Tenere la punta dell'ago di RNA immersa nell'olio fino al momento dell'iniezione.

Caricare gli embrioni nella piastra di iniezione usando una pipetta Pasteur e una pompa a pipetta, quindi utilizzare un dito guantato per premere delicatamente le uova negli abbeveratoi. Inietta 10 picogrammi ndr2 RNA nel tuorlo di embrioni monocellulari fino a raggiungere il numero desiderato di embrioni o fino a quando gli embrioni iniziano a dividersi. Utilizzare un leggero flusso di acqua per uova da una bottiglia di spremiture per lavare gli embrioni dalla piastra di iniezione in una capsula di Petri etichettata.

Posizionare gli embrioni nell'incubatrice a 28,5 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio cellulare 128. Rimuovere le uova non fecondate e gli embrioni morti dal piatto. Una volta che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di 128 cellule, metterli in piastre di Petri di vetro etichettate e decantare quanta più acqua di uova possibile da loro.

Etichettare i piatti cristallizzanti in vetro con nastro da laboratorio corrispondente ai nomi dei piccoli piatti e riempire due terzi del percorso con acqua all'uovo. Posiziona questi piatti accanto al microscopio di dissezione per una rapida accessibilità. Aggiungere un millilitro di 20 milligrammi per millilitro di pronasi, scongelato sul ghiaccio a 15 millilitri di soluzione di 3X Danieau in un tubo conico da 50 millilitri.

Aggiungere almeno cinque millilitri di soluzione di pronasi a ciascuna capsula di Petri di vetro contenente embrioni. Agitare le stoviglie di vetro con un movimento circolare, monitorando costantemente l'andamento della deconionezione al microscopio sezionante. Una volta che le cori iniziano a raggrinzirsi e uno o due embrioni sono fuori dalle loro corioni, immergere con cura la capsula di Vetro di Petri contenente pronasi e gli embrioni nel corrispondente piatto cristallizzante di vetro contenente acqua d'uovo.

Lavare gli embrioni di deconionezione tre volte con acqua d'uovo e decantare l'acqua dell'uovo dal piatto. Eseguire il terzo e ultimo lavaggio con la soluzione 0,3X di Danieau. Coprire gli embrioni decorionati con un coperchio della capsula di Petri e riportarli all'incubatrice a 28,5 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio a 256 cellule.

Riempire una capsula di Petri rivestita di agarose con la soluzione di 3X Danieau. Una volta che gli embrioni sono allo stadio di 256 cellule, trasferiscili nella piastra rivestita di agarose contenente la soluzione di 3X Danieau, allineandoli lungo il centro del piatto. Usa un paio di pinci, tenuti chiusi per stabilizzare l'embrione, e usa l'altro per tagliare il blastoderma.

Per tagliare, spremere delicatamente le cellule del blastoderma con un paio di pinzlette, quindi prendere la pinzante stabilizzante e farle scorrere lungo le altre pinze per affettare circa a metà del blastoderma. Ruotare l'embrione, posizionando la pinca nel taglio esistente e quindi tagliare il blastoderma ortogonale rimanente al primo taglio. Conservare gli espianti nella soluzione di 3X Danieau per almeno cinque minuti per guarire, quindi trasferirli nel pozzo rivestito di agarose di una piastra a sei pozzetti riempita con quattro millilitri di mezzi di espianto.

Posizionare le piastre di coltura di espianto nell'incubatore a 28,5 gradi Celsius fino a raggiungere il punto o lo stadio desiderato. Per tagliare gli espianti chimerici, utilizzare un piatto con agarose modellato in 12 piccoli pozzi poco profondi usando perle di vetro da un millimetro. Riempire il piatto con la soluzione 3X Danieau.

Preparare aggiungendo 12 embrioni di un genotipo o condizione sul lato sinistro della piastra e 12 embrioni dell'altro genotipo sono condizionati sul lato destro della piastra. Spostare un embrione di ogni condizione al centro della piastra vicino a uno dei 12 pozzi. Usando la pinna, taglia un espianto da ciascun embrione come descritto per gli espianti di un singolo embrione.

Premere rapidamente i bordi tagliati dei due espianti insieme all'interno del pozzo poco profondo usando una pinna per consentire alle due metà di guarire insieme in un unico espianto. Continuare con i restanti 12 pozzi all'interno della piastra. Una volta che gli espianti sono guariti, trasferirli nel pozzo rivestito di agarose di una piastra a sei pozzetti riempita con quattro millilitri di mezzi di espianto.

Ripetere fino a raggiungere il numero desiderato di espianti. La coltura espianta nell'incubatrice a 28,5 gradi Celsius fino a quando gli embrioni fratelli intatti hanno raggiunto lo stadio desiderato. Gli espianti di controllo tagliati dagli embrioni selvatici non infetti o quelli iniettati con 50 picogrammi di mRNA che codificano per la proteina fluorescente verde sono rimasti arrotondati per tutto il periodo di coltura e non sono riusciti a esprimere marcatori di mesoderma, endoderma o neuroectoderma.

Gli espianti tagliati da embrioni iniettati con 10 picogrammi di mRNA ndr2 sono diventati molto allungati dopo otto-nove ore di coltura. L'imaging time-lapse dal vivo di questi espianti mediante microscopia a contrasto interferente differenziale ha rivelato che l'estensione inizia a o intorno a otto ore dopo la fecondazione. Gli espianti da embrioni iniettati con 10 picogrammi di ndr2 hanno mostrato una robusta espressione dei marcatori del mesoderma, tbxta, noto, tbx16 e del marcatore del neuroectoderma sox2.

È molto importante tagliare gli espianti ben al di sopra del margine embrionale. Altrimenti, gli espianti conterranno segnali endogeni dal margine e non saranno ingenui. In questo metodo, gli espianti sono stati utilizzati per affrontare il ruolo della segnalazione nodale nella morfogenesi della gastrulazione.

In futuro, altri ricercatori potrà utilizzare questo approccio per testare il ruolo di ulteriori molecole di segnalazione, ad esempio in qualsiasi numero di processi di sviluppo.