Name: Visualizzazione dellattività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri come creare linee di zebrafish transgenici per visualizzare i cambiamenti elettrici cellulari durante l'embriogenesi e la formazione tumorale in vivo. Questo metodo consente il tracciamento in tempo reale dei segnali bioelettrici.

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Il lavoro di ricerca riportato in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto il premio numero R35GM124913, Purdue University PI4D programma di incentivazione e PVM interno competitivo Programma di fondi di ricerca di base. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale degli agenti finanziamenti. Ringraziamo il costrutto Tol2, Michael Lin per il costrutto ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon per il promotore ubi costruire attraverso Addgene.

Zebrafish sono alloggiati in una struttura animale AAALAC-approvato, e tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo i protocolli approvati dalla Purdue Animal Care and uso Comitato (PACUC).
1. Tol2 trasposone Miniprep costrutto
Nota: Tol2, un trasposone che è stato scoperto nei pesci medaka, ampiamente è stato utilizzato nello zebrafish ricerca comunità8,9. È stato adottato per il Gateway del sito ricombinazione clonazione sistema basato e conosciuto come il Tol2 kit10con successo. Il kit Tol2 permette per un modo più conveniente di creare costrutti di espressione personalizzata, ma anche di aumentare l'efficienza della transgenesi. Così, era una decisione facile da prendere vantaggio di questo sistema e creare un'onnipresente ASAP1 espressione zebrafish riga utilizzando un promotore convalidato ubiquitina guidare ASAP111.
<ol><li>Creazione di una costruzione centrale voce ASAP1: pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Acquisire il codificato geneticamente Tensione sensore ASAP1 costruire, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), da Addgene. Per amplificare la regione di codificazione di ASAP1, è possibile impostare una PCR utilizzando i primer su misura (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) fiancheggiati da sequenze di attB all'estremità 5' dei primer (Figura 1). Phusion DNA polimerasi è stato scelto per la sua elevata efficienza e condizioni di PCR sono state ottimizzate basati sul protocollo precedentemente pubblicato12.</li>
		<li>Caricare i prodotti di PCR 50 µ l in un 1% TAE gel utilizzando una pipetta regolare con punte di 200 µ l ed eseguire l'elettroforesi a 160 V in un serbatoio orizzontale gel per circa 30 min.</li>
		<li>Verifica il gel sotto un transilluminatore UV (353 nm), asportare fuori la banda desiderata utilizzando un bisturi a lama/sotto un transilluminatore UV come precedentemente pubblicati13,14e mettere il campione di DNA contenente gel in una microcentrifuga pulito 1,5 mL tubo.</li>
		<li>Eseguire purificazione del gel per i prodotti di PCR di ASAP1. Recuperare il DNA nel gel asportato utilizzando un kit di purificazione dei gel DNA commerciale seguendo le istruzioni del fabbricante ed eluire il DNA in 20 µ l di acqua. Prendere 1 µ l come un campione e misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Le istruzioni del software utilizzando l'acqua come un controllo vuoto15del flusso.</li>
		<li>Prendere 100 ng di purificato prodotto di PCR e mescolarla con 150 ng di plasmide pDONR221 a 10 µ l di TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Aggiungere 2 µ l di BP Clonase II nella reazione e incubare la reazione a temperatura ambiente durante la notte.</li>
		<li>Il secondo giorno, aggiungere 1 µ l di proteinasi K nella reazione e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Eseguire la trasformazione. La reazione di trasferimento e mescolare con 50 µ l di Top10 competenti Escherichia coli cellule e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min. Poi, trasferire la provetta di reazione in bagnomaria a 42 ° C per 1 min. immediatamente rimuovere il tubo e incubare in ghiaccio per 2 min. Successivamente, mettere il tubo in uno shaker di 37 ° C ed incubare per 1 h.</li>
		<li>Estrarre il tubo e piastra le cellule su un piatto di kanamicina LB. Successivamente, incubare la piastra durante la notte (16-18 h) a 37 ° C.</li>
		<li>Scegli colonie singole e ben separate e inoculare loro in provette di coltura cellulare di 14 mL con 3 mL di terreno LB. Li della coltura durante la notte a 37 ° C in uno shaker con una velocità di rotazione di 250 giri/min (rotazione al minuto).</li>
		<li>Eseguire miniprep utilizzando un kit commerciale miniprep seguendo il manuale di istruzioni17.</li>
		<li>Sequenza 3-4 plasmidi con Sanger sequenziamento per identificare positivo pDONR221-ASAP1 cloni utilizzando primer di sequenziamento di M13F e M13R.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Creando il costrutto Tol2 per il microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1<ol>
<li>Scegliere che il sequenziamento verificato misura e pDONR221-ASAP1 clone sua concentrazione di DNA usando un seguito di spettrofotometro l'istruzione software usando l'acqua come un vuoto di controllo15.</li>
		<li>Prendere 100 µ g di pDONR221-ASAP1 e mescolare con 100 µ g del Tol2 kit 5-fine del plasmide (pENTR5'_ubi, Addgene n. 27320), 100 µ g di p3E-polyA (Tol2 kit #302) e 150 µ g di pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Regolare volume totale a 8 µ l utilizzando il buffer di TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) in una microcentrifuga da 1,5 mL provetta e mescolare bene da un vortice breve di 2-5 s. Quindi, aggiungere 2 µ l di LR Clonase II plus e incubi la reazione a temperatura ambiente durante la notte.</li>
		<li>Il secondo giorno, aggiungere 1 µ l di proteinasi K nella reazione usando una pipetta a 10 µ l e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Eseguire la trasformazione e identificare i cloni positivi come descritto sopra (punti 1.1.7-11).</li>
		<li>Misura la concentrazione di DNA di sequenziamento verificato pDestTol2-ubi-ASAP1 clone (Figura 1B) utilizzando un spettrofotometro15. La concentrazione è solitamente intorno 200ng / µ l.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparare Tol2 Transposase mRNA e soluzione iniettabile
<ol><li>Striscia e. coli glicerolo stock di pCS2FA-transposase plasmide (Tol2 kit #396) su una piastra di LB (con 100 ampicillina µ g/mL) utilizzando un ciclo di inoculazione sterilizzato. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore per una notte. Il giorno successivo, prendere una singola Colonia e inoculare esso in 3 mL di LB (ampicillina 100 µ g/mL) usando una pipetta sterilizzata di 10 µ l. Della coltura durante la notte a 37 ° C in uno shaker con una velocità di rotazione di 250 giri/min.</li>
	<li>Eseguire miniprep sulla cultura di e. coli utilizzando un kit commerciale miniprep seguendo il manuale di istruzioni. Eluire il DNA del plasmide in 30-50 µ l di tampone di TE da 1 minuto Centrifugare a 14.000 giri/min e misurare la sua concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.</li>
	<li>Linearizzare µ g di 1-2 del plasmide con non ho endonucleasi e purificare il DNA con un DNA pulizia kit seguendo il manuale di istruzioni dopo che non ho la digestione. Eluire il DNA in 5 µ l di acqua mediante centrifugazione a 14.000 rpm per 1 minuto. La concentrazione attesa è di circa 200-300 ng / µ l.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione in vitro con non linearizzato pCS2FA-transposase come un modello di DNA utilizzando un kit di trascrizione SP6 commerciale.</li>
	<li>Una volta terminata la reazione, purificare Tol2 transposase mRNA usando una pulizia commerciale RNA kit seguendo le istruzioni del produttore. Infine, eluire mRNA in acqua RNAse-libera di 20 µ l e misurare la concentrazione di RNA in uno spettrofotometro. La concentrazione attesa è di circa 1-3 µ g / µ l. campioni possono essere conservati in un congelatore a-80 ° C, se necessario.</li>
	<li>Preparare la soluzione di microiniezione mescolando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-transposase ASAP1 e Tol2 mRNA (100 ng / µ l) in un tubo del microcentrifuge pipettando. Per impedire la degradazione dell'acido nucleico causata da scongelamento ripetuti e ricongelare, aliquotare 6 µ l per provetta e memorizzarlo in un congelatore-80 ° C per un uso futuro.</li>
</ol>3. microiniezione
<ol><li>Impostare 4-6 vasche di allevamento con almeno 2 maschi e 2 femmine il pomeriggio prima dell'iniezione. Questi pesci non devono essere alimentati nel pomeriggio. Questo passaggio verrà ridurre la quantità di rifiuti di pesce e risparmiare tempo per pulire fuori la mattina successiva, aiutando anche per indurre una risposta di allevamento.</li>
	<li>La mattina seguente, rimuovere la soluzione preparata iniezione (pDestTol2 -ubi-ASAP1 costrutto e Tol2 mRNA) dal congelatore-80 ° C e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Tirare i divisori nel pesce di allevamento serbatoi e consentire il pesce ad accoppiarsi. In generale, pesci depongono le uova all'interno di 20-30 minuti dopo aver tirato fuori il divisore. Se non, attendere 1-2 ore in più. Alcuni pesci non possono affatto depongono le uova. In questo caso, è possibile ripetere questo esperimento per la raccolta di embrioni di pesce.</li>
	<li>Durante l'attesa, assicurarsi che non ci sono aghi preparati con la punta rotta in un angolo che crea un bordo smussato con forcipe o rompendo il tergicristallo un compito delicato.<ol>
<li>Tirare aghi da vetro capillare su un estrattore micropipetta utilizzando i seguenti parametri: calore 545; tirare 60; velocità 80; tempo 250; pressione 500. Rompere l'ago con una pinza sotto un ambito di dissezione (con oculare righello per la stima del diametro) tenendo il forcipe a un angolo di circa 45 °. Diametri degli aghi desiderata possono essere variabile a seconda delle impostazioni di microinjector, ma più piccolo diametro è comodo per fare diminuire la mortalità embrionale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglierli in un diametro di 10 cm di Petri e portarli all'ambito di dissezione. Rimuovere tutti gli embrioni anormali e rifiuti di pesce.</li>
	<li>Dispensare gli embrioni fecondati nell'iniezione di preparati agarosio al 3% della muffa. Rimuovere l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in luogo.</li>
	<li>Una volta che tutte le righe sono pieni di embrioni vitali, disporli in modo che le singole celle tutti rivolti nella stessa direzione verso l'ago, che è circa un angolo di 45° in orizzontale. Questo faciliterà iniezione molto più tardi.</li>
	<li>Anche con i guanti, utilizzare una pipetta di caricamento di 20 µ l punta e rimuovere 5 µ l del costrutto preparato dal tubo sul ghiaccio.</li>
	<li>Inserire delicatamente la punta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino a dove inizia a tapper, come per ottenere il reagente più vicino alla punta. Se ci sono ancora delle bolle d'aria, agitare l'ago, facendo attenzione a non rompere la punta.</li>
	<li>Inserire l'ago direttamente nel porta-aghi microiniezione e serrare con cautela fino a quando l'ago rimane al suo posto. Regolare l'angolo di circa 45°.</li>
	<li>Una volta che l'ago è preparato e collegato, accendere il microscopio e gas serbatoio a pressione. Delle imprese CO2 serbatoi sono generalmente buoni per questo scopo. Il volume di iniezione viene regolato dalla pressione di detenzione ed espulsione: approssimativa 0,5 psi per detenzione e a 30 psi per espulsione. Assicuratevi di controllare che la soluzione viene fuori quando si preme il pedale.</li>
	<li>Utilizzando un micrometro con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a ~ 150 µm di diametro (circa 2 nL). Assicurarsi che la pressione posteriore vi permetterà una piccola quantità di gocciolare fuori dell'ago. Se non c'è abbastanza pressione, azione capillare provoca liquido inserire l'ago e distruggere il mRNA.</li>
	<li>Una volta che l'ago è calibrato, cominciare a iniettare il costrutto la singola cella degli embrioni fecondati. Nota: Questo richiede una grande quantità di pratica, pazienza e finezza, a causa della membrana delle cellule, essendo difficile da perforare. È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo, per la generazione di zebrafish transgenici. Questo è diverso dall'iniezione di morpholino. Non importa quale lato l'ago entra nella cellula fintanto che il costrutto va nella cella. La transgenesi avrà un tasso molto basso di successo se iniettato nel tuorlo invece della cella. Cella singola fase iniezione è anche importante, o pesce chimera somatico verrà creato. Questo ridurrà le possibilità del transgene andando alle cellule germinali.</li>
	<li>Utilizzare il bordo della tacca gel per fornire un supporto che mantiene l'embrione in posizione e permette l'ago applicare pressione senza spostare l'embrione. Una volta che la punta dell'ago è nella cella singola, premere il pedale per rilasciare la quantità desiderata di soluzione. Ripetere questo processo per tutti gli embrioni.</li>
	<li>Al termine dell'operazione, è possibile trasferire gli embrioni iniettati in un piatto con etichettato risciacquandole fuori la tacca di agarosio con acqua sistema di pesci e delle pipette monouso 3,4 mL. Conservare gli embrioni in un incubatore di 28,5 ° C per far loro sviluppare. Controllare indietro per tutto il giorno di rimozione di embrioni di pesce morto e sostituire l'acqua con blu di metilene 0,1% in acqua pesci.</li>
	<li>Circa 6-8 ore dopo l'iniezione, individuo di prendere 10 iniettato embrioni di pesce e preparare il DNA genomico da loro usando il metodo di Hotshot18.</li>
	<li>La mattina seguente, utilizzare un microscopio di dissezione con una sorgente di luce di fluorescenza per ordinare fuori gli embrioni risultati GFP nei tessuti non-tuorlo. Questi embrioni di pesce dovrebbero contenere il costrutto iniettato.</li>
	<li>Eseguire analisi di accise Tol2 per controllare l'attività di trasposizione come descritto in precedenza19. Se asportato plasmide può essere rilevata, mantenere l'iniettato embrioni di pesce e farli crescere. Se nessun plasmide asportata può essere rilevato, ripetere il processo di sintesi e microiniezione di Tol2 mRNA fino a raggiungere i risultati positivi del test delle accise Tol2.</li>
</ol>4. stabilire dei pesci transgenici ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
<ol><li>Come descritto in precedenza nel libro zebrafish20, sollevare il pesce iniettato (generazione0 F) fino all'età adulta. Questo di solito dura circa 4 mesi.</li>
	<li>Prendere un singolo adulto F0 pesce e attraversarlo con un unico fronte genere wildtype pesce. Raccogliere pesci embrioni dopo la nidificazione nel corso della giornata. Tenere gli embrioni di pesci raccolti nell'incubatrice 28,5 ° C nei pesci di acqua con 0,1% di blu di metilene.</li>
	<li>Il terzo giorno, controllare gli embrioni di pesce sotto un microscopio fluorescente dissezione con un filtro GFP. Risolvere gli embrioni di pesce verde, se ne esistono e farli crescere fino all'età adulta come pesci transgenici di F1 generazione, Tg (ubi: ASAP1). Nota: Rapporto mendeliana non dovrebbe dato che la maggior parte del pesce0 F parentale sono chimere genetica germinale.</li>
	<li>Attraversare il singolo F1 adult pesce con pesce wildtype e raccogliere embrioni di pesce. Ordina fuori embrioni di pesce verde e farli crescere fino all'età adulta come pesce di generazione2 F. Nota: Verde e gli embrioni non-verde pesce dovrebbero essere vicino a 1:1 se c'è un transgene singolo.</li>
	<li>Per visualizzare le modifiche potenziali elettriche nel tumore come tumori del fodero del nervo periferico maligno (MPNST), attraversare la generazione F di2 Tg (ubi: ASAP1) pesce con pesce rpl35hi258/wt . È noto che i tumori visibili iniziano a essere trovato nel 6-8 mese vecchio adulti21,22.</li>
</ol>5. imaging
<ol><li>Immagine di embrioni di zebrafish, prendere più fondatore di generazione2 F pesce e li attraversano con wildtype pesce in singole coppie. Raccogliere pesci embrioni a diversi stadi di sviluppo desiderati secondo zebrafish Guida23di gestione temporanea.</li>
	<li>Per le fasi iniziali di embrioni di pesce, sbucciare e rimuovere chorions degli embrioni con attenzione usando un paio di pinze in un ambito di dissezione in un diametro di 10 cm di Petri con acqua sistema di pesci.</li>
	<li>Trasferire alcuni embrioni di pesce su un vetrino concavo con metilcellulosa 3% utilizzando una pipetta monouso 3,4 mL. Regolare gli embrioni nelle posizioni desiderate per visualizzare l'attività GFP cellulare utilizzando un ago sotto un ambito di dissezione fluorescente.</li>
	<li>Per le fasi di movimento di embrioni di pesce (più vecchi di 12 stadi somite), è possibile utilizzare mesylate tricaina 0.05% per anestetizzare gli embrioni di pesce prima di trasferirli a diapositive. Brevemente, embrioni di pesce erano emerse in 0.05% tricaina mesylate in pesci d'acqua fino a quando hanno smesso di nuotare ed equilibrio corpo perdita. Inoltre, aggiungere una goccia di 0.05% tricaina mesylate con la metilcellulosa sulla diapositiva.</li>
	<li>Per meno di 12 embrioni somite fase pesce, è necessario utilizzare un microscopio composto di epi-fluorescenza con una fotocamera compatibile e software per l'imaging. Per più di 12 embrioni di pesce fase somite, utilizzare un microscopio di dissezione di fluorescenza.</li>
	<li>A immagine di tensione delle cellule del tumore, in primo luogo identificare il pesce con i tumori MPNST. Quindi, anestetizzare il pesce con 0.05% tricaina mesylate. Per l'intero supporto imaging, mettere il pesce in un diametro di 10 cm di Petri. Per visualizzare l'attività elettrica delle cellule del tumore, i tumori pesce potrebbero essere dissecati fuori dopo formazione immagine intero supporto.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Sebbene le attività di elettrico livello cellulare e tissutale durante lo sviluppo embrionale e malattia umana sono stati scoperti molto tempo fa, i cambiamenti dinamici elettrici in vivo e loro ruoli biologici ancora rimangono in gran parte sconosciuti. Una delle sfide principali è quello di visualizzare e quantificare i cambiamenti elettrici. Tecnologia di patch clamp è un'innovazione per tenere traccia delle singole cellule, ma la sua applicazione agli embrioni vertebrati è limitato perché sono composte di mo...

Bioelettricità si riferisce a segnali elettrici endogeno mediato da canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare1. Lo scambio ionico attraverso la membrana cellulare e le modifiche correnti e potenziali elettriche accoppiate, è essenziale per la segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili. Inoltre, bioelettricità e gradienti ionici hanno una varietà di altre importanti funzioni biologiche, tra cui la conservazione dell'energia, biosintesi e trasporto del metabolita. Bioelettrica di segnalazione è stato scoperto anche come regolatore della formazione embrionale modello, come assi di corpo, il ciclo cellulare e di differenziazione delle cellule1. Pertanto, è fondamentale per la comprensione di molte malattie congenite umane che derivano da mis-regolamento di questo tipo di segnalazione. Anche se toppa morsetto è stato ampiamente utilizzato per la registrazione di singole cellule, è ancora lungi dall'essere ideale per il monitoraggio simultaneo di più celle durante lo sviluppo embrionale in vivo. Inoltre, tensione sensibili piccole molecole non sono anche ideali per applicazioni in vivo a causa della loro specificità, sensibilità e tossicità.
La creazione di una varietà di geneticamente codificato fluorescente tensione indicatori (GEVIs) offre un nuovo meccanismo per superare questo problema e permette per una facile applicazione studiare lo sviluppo embrionale, anche se essi sono stati originariamente inteso per monitoraggio neurale cellule di2,3. Uno della GEVIs attualmente disponibile è il sensore accelerato di potenziali di azione 1 (ASAP1)4. Si compone di un ciclo extracellulare di un dominio di rilevamento di tensione di tensione sensibile fosfatasi e una proteina fluorescente verde circolarmente permutata. Pertanto, ASAP1 permette la visualizzazione dei cambiamenti potenziali elettrici cellulari (polarizzazione: verde brillante; depolarizzazione: verde scuro). ASAP1 ha 2 ms on-e off cinetica e può tenere traccia di sottosoglia potenziale cambiamento4. Così, questo strumento genetico permette un nuovo livello di efficacia nel monitoraggio in tempo reale bioelettrica in cellule vive. Ulteriore comprensione dei ruoli di bioelettricità nello sviluppo embrionale e molte malattie umane, quali il cancro, sarà gettato nuova luce sui meccanismi sottostanti, che è fondamentale per la prevenzione e trattamento della malattia.
Zebrafish hanno dimostrato un potente modello animale per studiare biologia inerente allo sviluppo e malattie umane, compreso cancro5,6. Essi condividono geni ortologhi di 70% con gli esseri umani, e hanno simile vertebrati biologia7. Zebrafish fornire cura relativamente facile, una dimensione di grande frizione delle uova, trattabile genetica, transgenesi facile e trasparente esterno sviluppo embrionale, che li rendono un sistema superiore per in vivo imaging5,6. Una grande fonte di linee di pesci mutanti già presenti e un genoma completamente sequenziato, zebrafish fornirà una gamma relativamente illimitata della scoperta scientifica.
Per studiare in vivo in tempo reale attività elettrica delle cellule, approfittiamo del sistema modello zebrafish e ASAP1. In questo articolo, descriviamo come incorporare il biosensore fluorescente tensione ASAP1 il genoma di zebrafish utilizzando Tol2 trasposone transgenesi e visualizzare attività elettrica cellulare durante lo sviluppo embrionale, il pesce movimento larvale e nel tumore dal vivo .

<table><tbody><tr><td>Provette per colture cellulari da 14 ml</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>Coltura di E.Coli</td></tr><tr><td>Vasca per elettroforesi di agarosio</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>Eletroforesi del DNA</td></tr><tr><td>Agarosio RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>Per la produzione dei gel per iniezione</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>Amplificazione della regione codificante ASAP1 per il subclonaggio</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTTTCTGTGAAGCCA</td><td>Amplificazione della regione codificante ASAP1 per il subclonaggio</td></tr><tr><td>Ambito di dissezione in campo chiaro</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Decrioinazione, microiniezione, montaggio</td></tr><tr><td>Telecamera a colori</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Embrione di pesce registrazione di immagini</td></tr><tr><td>Vetrino concavo</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>Per la conservazione di embrioni di pesce durante il processo di imaging</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento monouso da 3,4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Embrioni di pesce e trasferimento d'acqua</td></tr><tr><td>Enzima endonucleasi, non I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>Per linearizzare il DNA plasmidico</td></tr><tr><td>Ambito di applicazione del composto epifuorescente</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Pesce imaging di embrioni</td></tr><tr><td>Endoscopio di dissezione stereo epifuorescente</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Imaging di embrioni di pesce</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa fluorescente</td><td>Dinamica del lume</td><td>X-cite seris 120</td><td>Sorgente luminosa per microscopi a fluorescenza</td></tr><tr><td>Pinze #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Dechorionazione e rottura dell'ago</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Miscela di enzimi</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Clonazione a ricombinazione Gateway BP</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasi II Plus enzima</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Clonazione a ricombinazione Gateway LR</td></tr><tr><td>Kit di recupero del DNA Kit di recupero del DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>Purificazione del gel del DNA</td></tr><tr><td>Punta di caricamento</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Per caricare la soluzione iniettabile negli aghi capillari</td></tr><tr><td>Metilcellulosa (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Montaggio di embrioni di pesce</td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Sopprime i focolai fungini nelle piastre di Petri</td></tr><tr><td>Stampo per microiniezione</td><td>Strumenti di scienza adattiva</td><td>TU-1</td><td>Per preparare il vassoio dello stampo in agaorse per contenere embrioni di pesce durante l'iniezione</td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>WPI</td><td>Iniettore pneumatico Picopump PV820</td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipolatore</td><td>WPI</td><td>Microiniettore MM3301R</td><td>Operazione di microiniezione</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette Strumento</td><td></td><td>Sutter P-1000</td><td>Per la preparazione dell'ago capillare</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>Per la calibrazione del volume di iniezione</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA in vitro</td></tr><tr><td>Telecamera monocolore</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Registrazione di immagini di embrioni di pesce</td></tr><tr><td>Kit di minipreparazione plasmidico</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Preparare piccole quantità di DNA plasmidico</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Per trattenere pesci o embrioni di pesce durante il processo di imaging</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentratore-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Pulizia dell'mRNA dopo trascrizione in vitro</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Per la misurazione delle concentrazioni di DNA e RNA</td></tr><tr><td>Micrometro da palcoscenico</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Calibrazione del volume di microiniezione</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>Amplificazione del DNA per la clonazione genica</td></tr><tr><td>Parete sottile capillari in vetro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Vetro grezzo per la realizzazione di ago cappilare</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 primer</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAAATGCCCTC</td><td>Tol2 assay excise Tol2-exR</td></tr><tr><td>primer</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAAAAAG</td><td>Tol2 excise test</td></tr><tr><td>TOP10 Chimicamente competente E. coli</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>Utilizzato per la trasformazione durante il clonaggio genico</td></tr><tr><td>Tricaina mesilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Per l'anestetizzazione di pesci o embrioni di pesce</td></tr><tr><td>Trans-illuminatore UV 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>Visualizzazione del DNA Bagno</td></tr><tr><td>d'acqua</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>Per il processo di trasformazione del clonaggio genico</td></tr></tbody></table>

visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelettricità, elettrico di segnalazione endogena mediata dai canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare, svolge i ruoli importanti nella segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili e molti altri processi biologici, come embrionali patterning inerente allo sviluppo. Tuttavia, c'è una necessità per il monitoraggio di attività elettrica in vivo nell'embriogenesi dei vertebrati. I progressi degli indicatori di tensione fluorescenti geneticamente codificato (GEVIs) hanno reso possibile fornire una soluzione per questa sfida. Qui, descriviamo come creare una tensione transgenici indicatore zebrafish utilizzando l'indicatore di tensione stabilito, ASAP1 (accelerato di sensore di potenziali di azione 1), come esempio. Il kit Tol2 e un promotore di zebrafish onnipresente, ubi, sono stati scelti in questo studio. Spieghiamo anche i processi di clonazione site-specific di Gateway, Tol2 basati su trasposone zebrafish transgenesi e il processo di imaging per tumori di embrioni e pesce pesce di fase iniziale utilizzando microscopi normali epifluorescente. Usando questa linea di pesce, abbiamo trovato che ci sono variazioni di tensione elettrica cellulare durante l'embriogenesi zebrafish e pesce larvale movimento. Inoltre, è stato osservato che in alcuni tumori del fodero del nervo periferico maligno zebrafish, il tumore le cellule erano generalmente polarizzate rispetto ai tessuti normali circostanti.

In un'iniezione di successo, più di embrioni di pesce 50% iniettato visualizzerà un certo grado di fluorescenza verde nelle cellule somatiche, e la maggior parte di loro sarà positiva dall'analisi di Tol2 trasposone accise (Figura 2). Dopo 2-4 generazioni di fuori-croce con pesce wildtype (fino a quando il pesce fluorescente raggiungere il 50%, il rapporto previsto mendeliano), i pesci transgenici sono stati utilizzati per l'esperimento di formazione immagine...

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una linea di zebrafish transgenica che consenta l'osservazione dei cambiamenti elettrici cellulari durante l'embriogenesi, il movimento larvale e nella genesi tumorale. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia dello sviluppo, della fisiologia e della biologia delle cellule tumorali, come ad esempio quali sono i ruoli fondamentali della segnalazione elettrica cellulare durante l'embriogenesi e nelle cellule tumorali? Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di tracciare la segnalazione elettrica cellulare in vivo e in tempo reale.Dopo aver preparato l'mRNA della trasposasi Tol2 e la soluzione iniettabile secondo il protocollo di testo, il pomeriggio prima dell'iniezione, allestire da quattro a sei vasche di riproduzione con almeno due maschi e due femmine. Per ridurre la quantità di rifiuti ittici e indurre una risposta riproduttiva, evitare di nutrire i pesci nel pomeriggio. La mattina seguente, rimuovere la soluzione per iniezione preparata dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi e metterla sul ghiaccio.Tirare i divisori nelle vasche di riproduzione dei pesci e permettere ai pesci di accoppiarsi. In generale, i pesci depongono le uova entro 20-30 minuti. Durante l'attesa, utilizzando un estrattore per micropipette con i seguenti parametri, estrarre gli aghi dal vetro capillare.Usa una salvietta da laboratorio per rompere l'estremità dell'ago e creare un bordo smussato. Un diametro più piccolo è preferibile per ridurre la mortalità embrionale. Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglietele in una capsula Petri di 10 centimetri di diametro.Immediatamente sotto il microscopio di dissezione, rimuovere tutti gli embrioni anomali e i rifiuti di pesce. Quindi pipettare gli embrioni fecondati in uno stampo per iniezione di agarosio al 3% preparato. Rimuovi l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in posizione.Una volta che tutte le file sono riempite con embrioni vitali, disponili in modo che le singole cellule siano tutte orientate con un angolo di 45 gradi orizzontalmente rispetto all'ago. Questo renderà l'iniezione molto più facile in seguito. Successivamente, indossando i guanti, utilizzare un puntale per pipetta di caricamento da 20 microlitri per rimuovere cinque microlitri del costrutto preparato dal tubo sul ghiaccio.Inserire con cautela la punta della pipetta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino al punto in cui inizia a assottigliarsi per avvicinare il più possibile il reagente alla punta ed espellerlo nel capillare. Se ci sono ancora bolle d'aria, agitare l'ago facendo attenzione a non rompere la punta. Inserire l'ago direttamente nel supporto dell'ago per microiniezione e serrare accuratamente fino a quando l'ago non rimane in posizione.Quindi regolare l'angolo a circa 45 gradi. Una volta preparato e fissato l'ago, accendere il microscopio e il serbatoio a pressione del gas. Regolare il volume di iniezione utilizzando circa 0,5 PSI per la tenuta e 30 PSI per l'espulsione.Verificare che la soluzione fuoriesca dall'ago quando si preme il pedale. Utilizzando un micrometro da tavolino con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a circa 10 micrometri di diametro. Assicurarsi che la contropressione consenta a una piccola quantità di soluzione di gocciolare dall'ago.Se non c'è abbastanza contropressione, l'azione capillare farà sì che il liquido entri nell'ago e distrugga l'mRNA. Una volta calibrato l'ago, inserirlo nella singola cellula degli embrioni fecondati utilizzando il bordo della tacca del gel per fornire un supporto che mantenga l'embrione in posizione e consenta all'ago di applicare pressione senza spostare l'embrione. Una volta che la punta dell'ago si trova nella singola cellula, premere il pedale per rilasciare la quantità di soluzione desiderata.È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo, per generare il pesce zebra transgenico. Ripeti questo processo per tutti gli embrioni. Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento da 3,4 millilitri e l'acqua del sistema per pesci per trasferire gli embrioni iniettati in un piatto etichettato sciacquandoli dalla tacca dell'agarosio.Conserva gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius per farli sviluppare. Controlla durante il giorno per rimuovere gli embrioni di pesce morti e sostituire l'acqua con lo 0,1% di blu di metilene nell'acqua di pesce. Circa sei-otto ore dopo l'iniezione, utilizzare 10 embrioni di pesce iniettati e il metodo hotshot per preparare il DNA genomico.La mattina seguente, utilizzare un microscopio da dissezione con una sorgente di luce fluorescente per selezionare gli embrioni che mostrano GFP nei tessuti non tuorlo. Questi embrioni dovrebbero contenere il costrutto iniettato. Eseguire un test di assaggio Tol2 per verificare l'attività del trasposone come descritto in precedenza.Se il plasma asportato può essere rilevato, conservare gli embrioni di pesce iniettati e allevarli. In caso contrario, ripetere il processo di sintesi dell'mRNA Tol2 e la micro iniezione fino a ottenere risultati positivi dal test dell'accisa Tol2. Per visualizzare embrioni di zebrafish, incrociare più pesci fondatori della generazione F2 con pesci selvatici in coppie individuali.Raccogli embrioni di pesce in diversi stadi di sviluppo desiderati secondo la guida alla stadiazione del pesce zebra. Per gli embrioni di pesce in fase iniziale nell'acqua del sistema ittico, sotto un cannocchiale di dissezione, utilizzare un paio di pinze per sbucciare e rimuovere con cura i corioni. Utilizzare una pipetta di trasferimento per lo smaltimento per trasferire alcuni embrioni in un vetrino concavo con il 3% di metilcellulosa.Quindi, utilizzando un ago sotto un cannocchiale di dissezione, regolare gli embrioni nelle posizioni desiderate per visualizzare l'attività cellulare della GFP. Per gli embrioni allo stadio inferiore a 12 somiti, utilizzare un microscopio composto per epifluorescenza con una fotocamera compatibile e un software per l'imaging. Per gli embrioni che hanno superato lo stadio di 12 somiti, utilizzare un microscopio per dissezione a fluorescenza.Per visualizzare il voltaggio delle cellule tumorali, identificare prima i pesci con tumori maligni della guaina del nervo periferico o MPNST. Mettere il pesce in una capsula di Petri di 10 centimetri di diametro ed eseguire l'imaging dell'intera montatura. Infine, dopo l'imaging, sezionare il tumore prima di visualizzare l'attività elettrica della cellula tumorale.In un'iniezione riuscita, oltre il 50% degli embrioni iniettati mostrerà un certo grado di GFP nelle cellule somatiche e la maggior parte di essi mostrerà un risultato positivo dal test dell'ascia del trasposone Tol2. Qui sono stati esaminati i cambiamenti del potenziale di membrana durante il ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale precoce del pesce zebra. Come si vede in questo video timelapse, le cellule si iperpolarizzano prima della formazione del solco di scissione.Inoltre, diversi tessuti hanno mostrato una varietà di potenziali di membrana in embrioni di pesce di età compresa tra uno e tre giorni. Ad esempio, il somite e il notocord erano generalmente iperpolarizzati rispetto ai tessuti e agli organi adiacenti. In questo embrione di pesce di due giorni, le attività elettriche neuromuscolari sono mostrate durante il movimento con variazioni di densità di colore corrispondenti alla trasduzione della segnalazione elettrica.Le proprietà bioelettriche delle cellule tumorali sono state esaminate in embrioni provenienti da incroci di pesci reporter ASAP1 con un mutante RPL35 che è incline a MPNST spontaneo. Rispetto ai tessuti circostanti, le cellule tumorali erano più polarizzate. Una volta padroneggiata, questa tecnica di microiniezione può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli embrioni di zebrafish dovrebbero essere nello stadio di una cellula per ottenere risultati ideali. Con il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo e della biologia cellulare per esplorare in vivo i cambiamenti di segnalazione elettrica nel pesce zebra e in altri organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una linea di pesce zebra transgenico mediante microiniezione.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

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Fonte: Williams, A. L., et al. Imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione delle cellule neurali in cresta in migrazione negli embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un protocollo di imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di zebrafish in tempo reale con alta risoluzione.

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Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

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