Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una linea di zebrafish transgenica che consenta l'osservazione dei cambiamenti elettrici cellulari durante l'embriogenesi, il movimento larvale e nella genesi tumorale. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia dello sviluppo, della fisiologia e della biologia delle cellule tumorali, come ad esempio quali sono i ruoli fondamentali della segnalazione elettrica cellulare durante l'embriogenesi e nelle cellule tumorali? Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di tracciare la segnalazione elettrica cellulare in vivo e in tempo reale.

Dopo aver preparato l'mRNA della trasposasi Tol2 e la soluzione iniettabile secondo il protocollo di testo, il pomeriggio prima dell'iniezione, allestire da quattro a sei vasche di riproduzione con almeno due maschi e due femmine. Per ridurre la quantità di rifiuti ittici e indurre una risposta riproduttiva, evitare di nutrire i pesci nel pomeriggio. La mattina seguente, rimuovere la soluzione per iniezione preparata dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi e metterla sul ghiaccio.

Tirare i divisori nelle vasche di riproduzione dei pesci e permettere ai pesci di accoppiarsi. In generale, i pesci depongono le uova entro 20-30 minuti. Durante l'attesa, utilizzando un estrattore per micropipette con i seguenti parametri, estrarre gli aghi dal vetro capillare.

Usa una salvietta da laboratorio per rompere l'estremità dell'ago e creare un bordo smussato. Un diametro più piccolo è preferibile per ridurre la mortalità embrionale. Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglietele in una capsula Petri di 10 centimetri di diametro.

Immediatamente sotto il microscopio di dissezione, rimuovere tutti gli embrioni anomali e i rifiuti di pesce. Quindi pipettare gli embrioni fecondati in uno stampo per iniezione di agarosio al 3% preparato. Rimuovi l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in posizione.

Una volta che tutte le file sono riempite con embrioni vitali, disponili in modo che le singole cellule siano tutte orientate con un angolo di 45 gradi orizzontalmente rispetto all'ago. Questo renderà l'iniezione molto più facile in seguito. Successivamente, indossando i guanti, utilizzare un puntale per pipetta di caricamento da 20 microlitri per rimuovere cinque microlitri del costrutto preparato dal tubo sul ghiaccio.

Inserire con cautela la punta della pipetta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino al punto in cui inizia a assottigliarsi per avvicinare il più possibile il reagente alla punta ed espellerlo nel capillare. Se ci sono ancora bolle d'aria, agitare l'ago facendo attenzione a non rompere la punta. Inserire l'ago direttamente nel supporto dell'ago per microiniezione e serrare accuratamente fino a quando l'ago non rimane in posizione.

Quindi regolare l'angolo a circa 45 gradi. Una volta preparato e fissato l'ago, accendere il microscopio e il serbatoio a pressione del gas. Regolare il volume di iniezione utilizzando circa 0,5 PSI per la tenuta e 30 PSI per l'espulsione.

Verificare che la soluzione fuoriesca dall'ago quando si preme il pedale. Utilizzando un micrometro da tavolino con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a circa 10 micrometri di diametro. Assicurarsi che la contropressione consenta a una piccola quantità di soluzione di gocciolare dall'ago.

Se non c'è abbastanza contropressione, l'azione capillare farà sì che il liquido entri nell'ago e distrugga l'mRNA. Una volta calibrato l'ago, inserirlo nella singola cellula degli embrioni fecondati utilizzando il bordo della tacca del gel per fornire un supporto che mantenga l'embrione in posizione e consenta all'ago di applicare pressione senza spostare l'embrione. Una volta che la punta dell'ago si trova nella singola cellula, premere il pedale per rilasciare la quantità di soluzione desiderata.

È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo, per generare il pesce zebra transgenico. Ripeti questo processo per tutti gli embrioni. Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento da 3,4 millilitri e l'acqua del sistema per pesci per trasferire gli embrioni iniettati in un piatto etichettato sciacquandoli dalla tacca dell'agarosio.

Conserva gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius per farli sviluppare. Controlla durante il giorno per rimuovere gli embrioni di pesce morti e sostituire l'acqua con lo 0,1% di blu di metilene nell'acqua di pesce. Circa sei-otto ore dopo l'iniezione, utilizzare 10 embrioni di pesce iniettati e il metodo hotshot per preparare il DNA genomico.

La mattina seguente, utilizzare un microscopio da dissezione con una sorgente di luce fluorescente per selezionare gli embrioni che mostrano GFP nei tessuti non tuorlo. Questi embrioni dovrebbero contenere il costrutto iniettato. Eseguire un test di assaggio Tol2 per verificare l'attività del trasposone come descritto in precedenza.

Se il plasma asportato può essere rilevato, conservare gli embrioni di pesce iniettati e allevarli. In caso contrario, ripetere il processo di sintesi dell'mRNA Tol2 e la micro iniezione fino a ottenere risultati positivi dal test dell'accisa Tol2. Per visualizzare embrioni di zebrafish, incrociare più pesci fondatori della generazione F2 con pesci selvatici in coppie individuali.

Raccogli embrioni di pesce in diversi stadi di sviluppo desiderati secondo la guida alla stadiazione del pesce zebra. Per gli embrioni di pesce in fase iniziale nell'acqua del sistema ittico, sotto un cannocchiale di dissezione, utilizzare un paio di pinze per sbucciare e rimuovere con cura i corioni. Utilizzare una pipetta di trasferimento per lo smaltimento per trasferire alcuni embrioni in un vetrino concavo con il 3% di metilcellulosa.

Quindi, utilizzando un ago sotto un cannocchiale di dissezione, regolare gli embrioni nelle posizioni desiderate per visualizzare l'attività cellulare della GFP. Per gli embrioni allo stadio inferiore a 12 somiti, utilizzare un microscopio composto per epifluorescenza con una fotocamera compatibile e un software per l'imaging. Per gli embrioni che hanno superato lo stadio di 12 somiti, utilizzare un microscopio per dissezione a fluorescenza.

Per visualizzare il voltaggio delle cellule tumorali, identificare prima i pesci con tumori maligni della guaina del nervo periferico o MPNST. Mettere il pesce in una capsula di Petri di 10 centimetri di diametro ed eseguire l'imaging dell'intera montatura. Infine, dopo l'imaging, sezionare il tumore prima di visualizzare l'attività elettrica della cellula tumorale.

In un'iniezione riuscita, oltre il 50% degli embrioni iniettati mostrerà un certo grado di GFP nelle cellule somatiche e la maggior parte di essi mostrerà un risultato positivo dal test dell'ascia del trasposone Tol2. Qui sono stati esaminati i cambiamenti del potenziale di membrana durante il ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale precoce del pesce zebra. Come si vede in questo video timelapse, le cellule si iperpolarizzano prima della formazione del solco di scissione.

Inoltre, diversi tessuti hanno mostrato una varietà di potenziali di membrana in embrioni di pesce di età compresa tra uno e tre giorni. Ad esempio, il somite e il notocord erano generalmente iperpolarizzati rispetto ai tessuti e agli organi adiacenti. In questo embrione di pesce di due giorni, le attività elettriche neuromuscolari sono mostrate durante il movimento con variazioni di densità di colore corrispondenti alla trasduzione della segnalazione elettrica.

Le proprietà bioelettriche delle cellule tumorali sono state esaminate in embrioni provenienti da incroci di pesci reporter ASAP1 con un mutante RPL35 che è incline a MPNST spontaneo. Rispetto ai tessuti circostanti, le cellule tumorali erano più polarizzate. Una volta padroneggiata, questa tecnica di microiniezione può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli embrioni di zebrafish dovrebbero essere nello stadio di una cellula per ottenere risultati ideali. Con il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo e della biologia cellulare per esplorare in vivo i cambiamenti di segnalazione elettrica nel pesce zebra e in altri organismi modello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una linea di pesce zebra transgenico mediante microiniezione.