Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Il mantenimento dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua delle cellule danneggiate e morenti senza interrompere la funzione di barriera. Per realizzare questo estrudere epiteliale, le cellule morenti formano e contraendo un anello di actina e miosina nella cellula che circonda la cellula morente per espellerla mentre si chiudono eventuali lacune che possono essere derivate dalla sua uscita. In questo articolo video, Un metodo per indurre e visualizzare l'estrusione di cellule apoptotiche dall'epidermide di pesci zebra larvali in tempo reale.

Come dimostrato, ciò si ottiene mediante iniezione di una sonda di actina F marcata con proteina fluorescente rossa in embrioni di zebrafish transgenico in uno stadio cellulare che esprimono la proteina fluorescente verde nell'epidermide per visualizzare i filamenti agenti nei tessuti epiteliali. Il quarto giorno, dopo la personalizzazione, le larve che esprimono sia GFP che RFP vengono quindi trattate con G 4 18 per indurre l'apoptosi nell'epidermide. La dinamica dell'actina e i cambiamenti di forma delle cellule epiteliali che si verificano durante l'estrusione sono visualizzati mediante imaging time-lapse su un microscopio confocale a disco rotante.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la forza immunitaria e le analisi, è che possiamo osservare rapidi cambiamenti e dinamiche di actina che si verificano durante il processo di estrusione in un tessuto epiteliale vivente. In questo video, vi mostreremo una procedura per l'estrusione di imaging di cellule apoptotiche dall'epidermide del pesce zebra in via di sviluppo in tempo reale. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per capire come le cellule riorganizzano in modo coordinato il loro citoscheletro di acton per rimuovere le cellule apoptotiche mantenendo la funzione di barriera e come l'interruzione del processo di estrusione può portare a determinati stati patologici.

Quindi iniziamo: per visualizzare le dinamiche di azione durante l'estrusione cellulare nell'epidermide del pesce zebra in via di sviluppo, inizia scongelando l'RNA precedentemente trascritto sul ghiaccio. Trascriviamo Mr.mRNA che codifica per la proteina fluorescente rossa fusa al calp nel dominio di omologia dell'utrofina e agiamo nella proteina legante. Aggiungere il rosso fenolo all'RNA in un rapporto uno a uno per una concentrazione finale di RNA di circa 30 nanogrammi per microlitro e caricare un microlitro di soluzione in un ago capillare tirato mediante riempimento posteriore.

Raccogli circa 75 embrioni di stadio C-K-G-F-P a 1 cellula in E tre tamponi. Pipettare gli embrioni raccolti nello stampo per microiniezione con una pipetta per pasta da cinque e tre quarti e orientare delicatamente gli embrioni nella mangiatoia con FST Dumont. Numero cinque, le pinze lavorano rapidamente per evitare di dover iniettare l'RNA in embrioni multistadio sotto uno stereomicroscopio da dissezione da laboratorio standard.

Utilizzare un micro iniettore a pressione controllata per iniettare l'RNA nel giogo degli embrioni come fossile di fenolo. Il rosso dovrebbe essere visibile nell'embrione dopo l'iniezione. Assicurati di iniettare almeno 50 embrioni per ogni esperimento.

Smista gli embrioni per rimuovere eventuali uova non fecondate o danneggiate e incubare tutti gli embrioni rimanenti a 28 gradi Celsius. Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio da dissezione fluorescente per selezionare embrioni di zebrafish che hanno un alto livello di fluorescenza GFP nell'epidermide e fluorescenza ad azione marcata RFP. Incubare gli embrioni selezionati a 28 gradi Celsius fino al momento di procedere con il trattamento farmacologico per indurre l'esposizione all'apoptosi all'amminoglicoside.

L'antibiotico G 4 18 o la medicina provoca l'estrusione di cellule apoptotiche dall'epidermide delle larve di zebrafish in via di sviluppo. È importante sottolineare che questo trattamento funziona solo su larve che sono quattro giorni dopo la fecondazione e più vecchie per indurre l'estrusione cellulare. Raccogliere fino a 25 larve di zebrafish 4 giorni dopo la fecondazione che esprimono sia GFP che RFP in una piastra di coltura di 35 x 10 millimetri contenente tre millilitri di terreno E tre.

Sostituire con cura il terreno con tre millilitri di E tre contenenti un milligrammo per millilitro di G quattro 18 e incubare la larva nel farmaco per quattro ore al buio a 28 gradi Celsius. Quindi rimuovere il terreno e sostituirlo con tre mezzi di preriscaldamento E contenenti lo 0,02% di trica e procedere al montaggio delle larve per montare le larve per l'imaging. Trasferire fino a tre larve in un tubo fendor da 1,5 millilitri e rimuovere la maggior parte del terreno E three.

Utilizzando una punta di pipetta tagliata, pipettare 120 microlitri di 1% a basso punto di fusione, mescolare la provetta. E poi pipettare delicatamente la miscela di larve e aro sul vetro di copertura sul fondo di un piatto di coltura matech. Utilizzando un supporto per perno FST con un perno di inserimento o un ago di tungsteno attaccato, orientare rapidamente le larve in modo che siano diritte e piatte contro il vetro di copertura.

Lasciare solidificare l'alce. Quindi riempire delicatamente il piatto con E tre medium contenente lo 0,02% di trica. Abbiamo scoperto che l'intero processo di estrusione di cellule apoptotiche dall'epidermide delle larve di zebrafish in via di sviluppo richiede circa 20 minuti.

Qui dimostriamo come impostare un esperimento di imaging time-lapse utilizzando un microscopio confocale a disco rotante e il software and o IQ per raccogliere una serie di piani Z attraverso un singolo strato dell'epidermide del pesce zebra. Innanzitutto, accendi la fotocamera del microscopio con laser al neon ad argon ed elio e la lampada fluorescente epi all'interno del software e o IQ. Creare un protocollo di serie temporali contenente le lunghezze d'onda da riprodurre.

La frequenza degli intervalli tra le acquisizioni di immagini e il numero di volte in cui l'acquisizione deve essere ripetuta Posizionare delicatamente il piatto opaco contenente il campione sul tavolino del microscopio e quindi utilizzare un obiettivo 20x con luce trasmessa per mettere a fuoco le larve. Spostare l'obiettivo ad immersione in acqua 40 volte nella posizione corretta. Utilizzando questo obiettivo, possiamo filmare circa 20-25 cellule per campo, il che ci consente di seguire i comportamenti cellulari durante l'estrusione, risolvendo anche le dinamiche di azione subcellulare.

Posizionare con cautela una goccia d'acqua sulla parte superiore dell'obiettivo 40 volte e posizionare rapidamente il piatto opaco sulla parte superiore. Identificare il campione utilizzando l'illuminazione a campo chiaro e quindi utilizzare l'epifluorescenza a 488 nanometri per concentrarsi in modo specifico sull'epidermide positiva alla GFP. Passa alla modalità di scansione confocale.

Regolare di conseguenza l'intensità del laser e il tempo di esposizione per ciascuno dei canali. Fare attenzione a bilanciare la potenza del laser e il tempo di esposizione per un rilevamento ottimale del segnale e per prevenire qualsiasi fototossicità. Per identificare le cellule estruse, utilizzare l'epifluorescenza per visualizzare l'epidermide marcata con GFP e identificare un gruppo di cellule in un classico schema a rosetta costituito da un insieme di cellule che circondano una piccola cellula rotonda al centro.

Inoltre, dovrebbe esserci un accumulo dell'actina marcata RFP visibile come un anello attorno alla piccola cella rotonda al centro, un segno distintivo dell'estrusione cellulare. Una volta identificata una cella di estrusione, impostare rapidamente i limiti superiore e inferiore per la serie Z e la dimensione del passo. Quindi iniziare ad acquisire quattro set di dati confocali D per visualizzare i dati e visualizzare la contrazione dell'anello di actina e i comportamenti epiteliali che si verificano intorno alla cellula morente.

Nel tempo, effettua proiezioni 3D della serie Z e salva i dati come file di filmato. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando una varietà di pacchetti software. Questa figura mostra l'espressione di RFP UTR CH nell'epidermide di larve di zebrafish CK GFP quattro giorni dopo la fecondazione.

Qui sono ancora in scena le proiezioni Z di un filmato time lapse che seguono le dinamiche della recitazione dal vivo. Durante il processo di estrusione delle cellule epiteliali vengono mostrate le frecce che denotano l'anello di actina formato dalle cellule vicine, che si contrae e si chiude nel corso di due minuti. Seguendo questa procedura, possiamo utilizzare altri metodi in combinazione con questa tecnica, come l'uso di inibitori chimici o mutazioni genetiche per capire meglio come l'alterazione dell'estrusione possa portare a determinati stati patologici.

A causa dell'incapacità di eliminare le cellule apoptotiche, vi abbiamo appena mostrato come impostare un esperimento di imaging time-lapse per visualizzare il processo di estrusione dall'epidermide del pesce zebra in via di sviluppo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di limitare la quantità di luce esposta al campione per evitare lo sbiancamento o la tossicità delle foto. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.