Name: Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri come visualizzare l'estrusione cellulare apoptotica nell'epidermide di Danio rerio in tempo reale. Questo metodo utilizza imaging confocale a disco rotante per studiare la dinamica dell'actina e il mantenimento dell'integrità tissutale.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Rosenblatt per discussioni scientifiche, suggerimenti e commenti. Vorremmo anche ringraziare Maria Halloran che ha gentilmente fornito la codifica plasmide RFP-UtrCH e David Grunwald che ha fornito il CK: GFP zebrafish transgenico. Grazie anche a Gretchen re e il personale della risorsa Zebrafish centralizzata presso l&#39;Università dello Utah per la manutenzione eccellente e la cura del pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Innovator Award di New NIH-NIGMS direttore del NIH di 1 DP2 OD002056-01 a JR. GTE è stato sostenuto dalla formazione multidisciplinare del cancro del NIH Grant Program 5T32 CA03247-8.

Flusso di lavoro di base per la visualizzazione di Dinamica actina durante l'estrusione cella nel Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo L'epidermide del pesce zebra di sviluppo è composto da due strati distinti, lo strato superficiale (o periderm) e uno strato basale di cellule che contattare la membrana basale 2. Le cellule dello strato superficiale esterno apoptosi e vengono eliminati dal tessuto di estrusione 3 (Figura 1). Per visualizzare questo processo in tempo reale, abbiamo iniettare RNA codifica una proteina fluorescente rossa fusa al dominio di omologia calponina utrophin, una proteina actina vincolante (RFP-UtrCH) 4,5, in una cella di zebrafish fase transgenici che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP ) sotto il promotore citocheratina epiteli stratificati 8 6 (Figura 2A). Anche se RFP-UtrCH è ubiquitariamente espressa l'animale dopo l'iniezione di RNA, ci concentriamo sulle cellule superficiali dell'epidermide che esprimono entrambe le RFP e GFP per seguire le dinamiche actina specificamente nell'epidermide (Figura 2B). Abbiamo poi trattare le larve con G418 di indurre apoptosi delle cellule di estrusione e l'immagine dei filamenti di actina epidermide e usando un microscopio confocale a disco rotante e di acquisire serie di dati 4D. Prima di iniziare l'esperimento <ol><li> In vitro trascrivere l'RNA da un modello di DNA linearizzato utilizzando il mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) e purificare l'RNA innevate utilizzando il RNeasy Mini kit (Qiagen). Diluire l'RNA a ~ 60ng/ul con acqua sterile, fare 3-5μl aliquote e conservare a -80 ° C fino al momento dell'iniezione. Nota: Evitare di congelare e ripetitivo / scongelamento per evitare la degradazione dell'RNA. </li><li> Fare uno stampo per tenere gli embrioni durante l'iniezione versando 40 ml di agarosio al 2% nel medio embrione E3 (E3) in un 15 millimetri x 100 piastra di coltura e l'immissione di uno stampo microiniezione (Adaptive Strumenti Scienza, # I-34) in questo vassoio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere lo stampo per esporre le depressioni in agarosio. Conservare la piastra a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo. </li><li> Tirare aghi capillare per iniezione utilizzando vetro borosilicato con filamenti (OD 1.0mm, ID 0,78, lunghezza 10 cm) e un P-97 Estrattore Pipettare Sutter a le seguenti impostazioni (Calore 485, Pull 50, velocità 60, Delay / ora 90, pressione 200 ). Nota: I diversi tipi di vetro richiede l'ottimizzazione delle condizioni elencate. </li><li> Costituiscono l'1% Low Melt (LM) agarosio in E3 e conservare 1mL aliquote a 42 ° C. Fare attenzione a come l'evaporazione di E3 dalle scorte può aumentare la concentrazione di agarosio. </li><li> Mantenere zebrafish adulti in condizioni di laboratorio standard, con un regolare luce / buio ciclo di 14 ore di luce e 10 ore di buio 7. La notte prima l'esperimento costituito di pesce di accoppiarsi mettendo 3 femmine e 2 maschi in una vasca separati da un divisorio. La mattina seguente, cambiare l'acqua nel serbatoio e tirare il divisore quando le luci si accendono. </li></ol> 1. L'iniezione di RNA codifica per la proteina fluorescente Actina Tagged Binding <ol><li> Scongelare il RNA sul ghiaccio. Aggiungere 0,5% rosso fenolo per l'RNA con un rapporto 1:1 per una concentrazione finale di RNA di ~ 30ng/μl e caricare 1ml soluzione in un ago capillare tirato da back-filling. </li><li> Raccogliere ~ 75 1-cellula fase 8 CK: embrioni GFP in E3. Preparare la pipetta raccolti embrioni nello stampo microiniezione con un 5 ¾ Pasteur e delicatamente orientare gli embrioni nella vasca con FST Dumont # 5 pinze. Nota: fare attenzione a lavorare in fretta per evitare di iniettare in un multi-cellula embrionale fase, che può portare a mosaico espressione dell'RNA iniettato. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio standard di laboratorio dissezione, iniettare l'RNA nel tuorlo degli embrioni usando una pressione controllata microinjector (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-iniettore). Una macchia rossa (rosso fenolo) dovrebbe essere visibile nell'embrione dopo l'iniezione. Iniettare almeno 50 embrioni per ciascun esperimento. (Vedere il precedente protocollo Giove per un protocollo dettagliato sulla iniezione di RNA in embrioni di zebrafish 9). Nota: <ol type="A"><li> Un volume di circa 2NL dovrebbe essere usato per l'iniezione di RNA in una cella-embrioni palco. Per determinare la quantità di RNA iniettato, dispensare un bolo di RNA in una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico calibrato o sotto un microscopio con una barra di scala costruita negli oculari. La goccia di RNA dovrebbe essere una sfera perfetta. Calcolare la quantità consegnata con la seguente equazione: Volume (in nl) = 4/3πr 3. Regolare il volume erogato, modificando la pressione di iniezione o il tempo sullo strumento. </li><li> Si deve inoltre fare attenzione a iniettare l'importo più basso di RNA che consente di visualizzare il fluoroforo, come alte concentrazioni di RNA possono essere tossici per l'embrione di sviluppo. Per determinare il livello appropriato di espressione, una curva dose-esperimento dovrebbe essere effettuato prima di eseguire l'esperimento. &lt;/ Li&gt; </li></ol></li><li> Ordina gli embrioni per rimuovere tutte le uova non fecondate o danneggiati e luogo tutti gli embrioni rimasti a 28.5 ° C. </li><li> Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio a fluorescenza dissezione per selezionare embrioni di zebrafish che hanno un alto livello di GFP (epidermide) e RFP (actina) fluorescenza. Mettere gli embrioni selezionati a 28,5 ° C fino al momento di procedere con il trattamento farmacologico per indurre l'apoptosi. </li></ol> 2. Induzione di estrusione in cella Le larve Zebrafish utilizzando G418 Abbiamo scoperto che l'esposizione al aminoglicoside antibiotico G418, o Geneticin, provoca apoptosi ed estrusione di cellule epidermiche nello sviluppo di larve di zebrafish 3 con un meccanismo sconosciuto. È importante sottolineare che questo trattamento funziona solo sulle larve che sono 4 giorni dopo la fecondazione e più anziani. Troviamo che ~ 5-25 cellule possono essere trovati estrusione in ogni momento dalla pinna epiteliali del pesce zebra G418 trattati larvale. Poiché la quantità di cellule apoptotiche estrusione può variare da pesce a pesce, è consigliato il montaggio più pesce per l'imaging. <ol><li> Raccogliere e posto 4 giorno dopo la fecondazione (DPF) larve di zebrafish espositrici sia GFP e RFP fluorescenza in un piatto da 35 x 10 mm cultura contenente 3 millilitri (ml) di E3. Si può trattare fino a 25 larve di questo piatto cultura dimensioni. </li><li> Ricollocare accuratamente i media con 3mLs dell'E3 1mg/mL contenenti delle larve G418 e incubare la droga per 4 ore a 28,5 ° C. Si noti che G418 è sensibile alla luce, in modo da fare attenzione a mantenere il piatto cultura coperto o al buio. </li><li> Rimuovere i supporti e sostituire con pre-riscaldato 28,5 ° C i media E3 contenente 0,02% Tricaine e procedere al montaggio delle larve. </li></ol> 3. Zebrafish Larve di montaggio per l'imaging <ol><li> Trasferimento 3 larve in una provetta eppendorf da 1,5 ml e rimuovere la maggior parte delle E3 dopo il lavandino pesce a fondo della provetta. Abbiamo scoperto che fino a 3 animali possono essere correttamente montato prima l'agarosio si solidifica. </li><li> Utilizzando una punta tagliata pipetta, 120ul pipetta di 1% LM-agarosio (42 ° C) nel tubo, mescolare, e poi delicatamente pipetta le larve e la miscela di agarosio sul coprioggetti sul fondo di un piatto cultura MatTek. </li><li> Utilizzando un supporto FST pin con un perno di inserimento o di tungsteno ago inserito, in modo rapido orientare le larve in modo che siano dritte e piatte contro il coprioggetti del piatto MatTek. Nota: Si utilizzano in genere un perno dritto al primo orientare le larve e poi una a forma di L pin per assicurare che siano piatti contro il coprioggetti evitando danni ai campioni. </li><li> Una volta che l'agarosio si è solidificato, gentilmente riempire il piatto con E3 contenente 0,02% Tricaine. Nota: in alternativa, G418 può essere aggiunto alla E3 nel piatto di imaging per continuare estrusione indurre, anche se a lungo termine dell'esposizione a 1mg/mL G418 ucciderà le larve. </li></ol> 4. Vivere Imaging di Dynamics actina e comportamenti individuali delle cellule epiteliali durante l'estrusione cella utilizzando un microscopio confocale Disco Spinning Abbiamo scoperto che l'intero processo di estrusione cellulare per apoptosi dall'epidermide di sviluppo di larve di pesce zebra dura circa 20 minuti 3. Qui mostriamo come impostare un time-lapse esperimento di imaging per raccogliere una serie di piani z attraverso un singolo strato dell'epidermide zebrafish di visualizzare il processo di estrusione. Abbiamo scoperto che widefield tipici microscopi a fluorescenza causa photobleaching significativa dei filamenti di actina e non consentono per l'imaging Timelapse. Pertanto, per ottimizzare la nostra risoluzione e prevenire photobleaching, usiamo un microscopio confocale a disco rotante. Di seguito viene descritto come impostare l'esperimento utilizzando il software IQ Andor con un microscopio Nikon, anche se i principi discussi possono essere applicati a microscopio simili set-up. <ol><li> In primo luogo, accendere la Argon (per l'eccitazione del BPA a 488 nm) e HeNe (per l'eccitazione del RFP a 561nm) laser, microscopio, macchina fotografica e lampada epifluorescente. </li><li> All'interno della IQ Andor software (versione 1.10.1), creare un protocollo di serie temporali contenente le lunghezze d'onda si vuole l'immagine, la frequenza degli intervalli tra cattura immagine e il numero di volte la cattura deve essere ripetuto. </li><li> Posizionare delicatamente il piatto MatTek contenente il campione sul palco microscopio e utilizzare un obiettivo 20x con luce trasmessa di concentrarsi sulle larve. </li><li> Spostare il 40X obiettivo immersione in acqua (NA 0,8) nella posizione corretta. Usando questo obiettivo, possiamo pellicola circa 20-25 cellule per campo, che ci permette di seguire comportamenti cellulari durante l'estrusione, mentre anche la risoluzione sub-cellulari dinamiche di actina. Nota: Il montaggio stesso e le strategie di imaging può essere applicata a microscopi diritti, anche se un obiettivo 40X immersione in acqua con una distanza di lavoro deve essere utilizzato. </li><li> Con attenzione una goccia d'acqua sulla parte superiore dell'obiettivo 40x e rapidamente posto il piatto MatTek in cima. None: Zeiss soluzione immersione Immersol può essere utilizzato anche se l'evaporazione dell'acqua è un problema. </li><li> Identificare il campione usando fase o illuminazione DIC e quindi utilizzare epifluorescenza 488 nm di concentrarsi specificamente sulle epidermide GFP positive. </li><li> Passare alla modalità di scansione confocale. Regolare l'intensità del laser e tempo di esposizione per ciascuno dei canali (488nm e 561nm) di conseguenza. Fare attenzione a bilanciare la potenza del laser e il tempo di esposizione per il rilevamento ottimale del segnale e per prevenire qualsiasi photobleaching o tossicità. </li><li> Per identificare le cellule estrusione, utilizzare epifluorescenza per visualizzare la GFP etichettato epidermide e di identificare un gruppo di cellule in un modello classico rosetta, costituita da un insieme di cellule che circonda una piccola cella rotonda al centro. Utilizzando la modalità di scansione confocale, ci dovrebbe essere anche un accumulo di actina RFP marcato visibili come un anello intorno alla piccola cella rotonda in mezzo, un segno distintivo di estrusione in cella. Dopo aver identificato una cellula estrusione, impostare rapidamente il microscopio per acquisire 4D (XYZ-Time) set di dati confocale. </li><li> Impostare i punti superiore e inferiore all'interno del piano z per visualizzare un singolo strato dell'epidermide, tra cui la cellula estrusione, e selezionare il passo. Per time-lapse imaging, impostare gli intervalli per l'acquisizione delle immagini e numero di ripetizioni. Per esempio, noi di solito acquisire una serie z-spanning 5-10μm, con una dimensione di 1 micron passo, ogni 1-2 minuti per 30 minuti. </li><li> Per visualizzare i dati, di solito fanno le proiezioni in 3-D della serie z e salvare il set di dati come file di filmato che è compatibile con Quick Time (Apple). In questo modo, possiamo visualizzare la contrazione del ring actina e comportamenti epiteliali che si verificano intorno alla cellula di morire nel corso del tempo. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica di estrusione cellulare per apoptosi. Filamenti di actina sono mostrati in rosso, le cellule GFP positive epidermiche sono verdi. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Flusso di lavoro sperimentale. A. Schema del flusso di lavoro per l'esperimento. B. Espressione di RFP-UtrCH nell'epidermide di un CK 4dpf: GFP zebrafish. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagini fisse (z-proiezioni) da un time-lapse movie che segue dal vivo le dinamiche dell'actina durante il processo di estrusione delle cellule epiteliali. Le frecce indicano l'anello di actina formate da cellule vicine che si contrae e si chiude nel corso di 2 minuti.

<ol><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li>
<li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li>
<li>Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
<li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%2C+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
</ol>

Benessere degli animali Assurance Tutte le procedure eseguite in questo protocollo con il pesce zebra, Danio rerio, sono stati approvati dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) presso l&#39;Università di Utah (Assurance benessere degli animali # 10-07017).

Il protocollo qui descritto viene illustrato un metodo semplice e diretto per visualizzare il processo di estrusione in un tessuto vivo epiteliale. Questo tipo di esperimento ci permette di esaminare sottigliezze delle dinamiche di actina in precedenza non apprezzati nelle analisi del tessuto fisso, e quindi, integra comuni metodi di immunofluorescenza. Possiamo usare questo protocollo in associazione con inibitori chimici o mutanti genetici per analizzare meglio il processo di estrusione e stati patologici studio assoc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reagente </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Serbatoi Crossing </td><td> Strumento </td><td> Thoren Aquatic Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La pompa Pipettare </td><td> Strumento </td><td> Bel Art Prodotti </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ pipetta Pasteur </td><td> Strumento </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microiniezione Mold </td><td> Strumento </td><td> Adaptive Scienza Tools </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura Piastra 100x15mm </td><td> Strumento </td><td> Pescatore </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipetta Puller </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> Modello P97 </td><td></td></tr><tr><td> Capillari in vetro borosilicato con filamento </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, ID 0,78 millimetri, lunghezza 10 centimetri </td></tr><tr><td> Conservazione elettrodi Jar </td><td> Strumento </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% nel DPBS </td></tr><tr><td> Pressione controllata Microinjector e Micromanipolatore </td><td> Strumento </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura Dish 35x10mm </td><td> Strumento </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> Reagente </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml in DH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12 centimetri Pin Holder </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserisci Pins </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26007-02 e-03 </td><td></td></tr><tr><td> Piatto di vetro Cultura basso con 1,5 coprioggetti </td><td> Strumento </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Low Melt agarosio </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescente microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio confocale Disco </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> Ti Eclipse </td><td> Dotato di un disco che gira la testa Yokagawa </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Macchina fotografica </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micron pixel quadrati </td></tr></tbody></table>

immagini dal vivo di estrusione in cella dal epidermide di zebrafish in via di sviluppo

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Mantenimento dell&#39;omeostasi dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate senza interrompere la funzione di barriera. I nostri studi hanno trovato che le cellule morenti inviare segnali ai loro vicini di formare e vivere contratto un anello di actina e miosina che lo espelle fuori dal foglio epiteliali durante la chiusura eventuali lacune che potrebbero avere provocato dalla sua uscita, un processo chiamato estrusione in cella 1. L&#39;ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrive un metodo per indurre e estrusione immagine nell&#39;epidermide zebrafish larvale. Per visualizzare estrusione, abbiamo iniettare una sonda rossa proteina fluorescente etichettato per la F-actina in una cella di embrioni di zebrafish fase transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde a livello epidermico e indurre apoptosi mediante l&#39;aggiunta di G418 di larve. Utilizziamo quindi time-lapse imaging su un microscopio confocale a disco rotante per osservare dinamiche di actina e dei comportamenti delle cellule epiteliali durante il processo di estrusione cellulare per apoptosi. Questo approccio ci permette di indagare il processo di estrusione a vivere epiteli e fornirà una via per studiare stati di malattia causata dalla mancata eliminazione di cellule apoptotiche.

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L&#39;ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell&#39;epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Il mantenimento omeostatico dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua delle cellule danneggiate senza compromettere la funzione di barriera. I nostri studi hanno dimostrato...

Il mantenimento dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate e morenti senza compromettere la funzione di barriera. Per raggiungere questo obiettivo, l'epitelio espelle le cellule morenti formando e contraendo un anello di actina e miosina nella cellula circostante la cellula morente, espellendola e chiudendo contemporaneamente eventuali lacune risultanti dalla sua uscita. In questo articolo video, viene descritto un metodo per indurre e visualizzare in tempo reale l'espulsione di cellule apoptotiche dall'epidermide di pesci zebra larvali.Ciò viene mostrato mediante l'iniezione di una sonda per l'actina F marcata con una proteina fluorescente rossa in embrioni di pesce zebra transgenici allo stadio di una singola cellula che esprimono la proteina fluorescente verde nell'epidermide, al fine di visualizzare i filamenti di actina nei tessuti epiteliali. Le larve di quattro giorni dopo la personalizzazione che esprimono sia GFP che RFP vengono quindi trattate con G418 per indurre l'apoptosi nell'epidermide. La dinamica dell'actina e le variazioni della forma delle cellule epiteliali che si verificano durante l'estruzione sono visualizzate mediante acquis

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In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Fonte: Williams, A. L., et al. Imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione delle cellule neurali in cresta in migrazione negli embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un protocollo di imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di zebrafish in tempo reale con alta risoluzione.

Visualizzazione della migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di pesce zebra utilizzando l'imaging time lapse multi-fotone

Studiando i primi eventi di progressione delle cellule preneoplastiche e interazione innata cellule immunitarie è fondamentale per comprendere e curare il cancro. Qui si descrive un metodo per indurre condizionale trasformazioni cellule epiteliali e la successiva di immagini dal vivo di interazione innata cellule immunitarie con HRAS G12V esprimono le cellule della pelle in larve di zebrafish.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l'uso in test di migrazione cellulare collettiva.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Combinando approcci di trapianto cellulare, marcatura citoscheletrica e perdita/guadagno di funzione, questo protocollo descrive come la piastra precordale prospettica del pesce zebra in migrazione possa essere utilizzata per analizzare la funzione di un gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Scopri come visualizzare l'estrusione cellulare apoptotica nell'epidermide di Danio rerio in tempo reale. Questo metodo utilizza imaging confocale a disco rotante per studiare la dinamica dell'actina e il mantenimento dell'integrità tissutale.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

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