Die Herstellung der thermoplastischen Mikrofluidikkanälen

Hallo, mein Name ist Aida Pria und ich habe gerade meine Doktorarbeit im Labor von Dr. Katherine KLAS hier an der bu abgeschlossen. Und heute werde ich die Herstellung eines thermoplastischen mikrofluidischen Geräts mittels Mikro-Heißprägung und thermischem Verkleben demonstrieren. Und dann werde ich die Isolierung von Nukleinsäuren mit einer festen Fläche demonstrieren, die Siliziumdioxidpartikel enthält, die und die extrahierten Nukleinsäuren dann für den PCR-Amplifikationsnachweis oder jedes andere Diagnosemodul verwendet werden können.

Hallo, mein Name ist Dominika Kalinski und ich bin Doktorandin am Biomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratory an der Boston University. Ich werde über die Bildung eines Lysemonolithen aus Kohlenstoffnanoröhren und eines mikrofluidischen Geräts sowie über die Bildung eines Festphasenextraktionsmonolithen für die DNA-Extraktion und eines mikrofluidischen Geräts sprechen. Heute demonstrieren wir ein Experiment zur Herstellung und Anwendung von mikroskaligen Lysesäulen und Solid Face Extraktionssäulen in thermoplastischen mikrofluidischen Kanälen.

Diese Säulen können für die bakterielle Zelllyse und die Isolierung von Nukleinsäuren aus dem Zelllysat verwendet werden. Der erste Schritt in diesem Prozess ist die Herstellung der mikrofluidischen Geräte. Bei zyklischem Polyolefin verwenden wir ein Polymer, das unter dem Handelsnamen xx XX six 90 R eine Gloster-Editionstemperatur von 136 Grad Celsius hat und UV-durchlässig ist.

Die UV-Transparenz ist sehr wichtig für die lichtgerichtete Chemie, die bei der Herstellung des porösen Monolithen in den mikrofluidischen Kanälen verwendet wird. Diese mikrofluidische Plattform wird durch Mikro-Heißprägung und thermisches Bonden hergestellt. Zuerst werde ich das Mikro-Heißprägeverfahren demonstrieren.

Wir beginnen also mit einer Urform, bei der es sich um eine galvanisch geformte Nickel-Kobalt-Form handelt, die die negativen oder umgekehrten Eigenschaften dessen aufweist, was auf der mikrofluidischen Plattform erforderlich ist. Also legen wir die Zion Nex-Paletten auf die Funktionen, die wir auf dem Kunststoffsubstrat benötigen. Anschließend wird die Form in eine Heißpresse gelegt, die auf bis zu 30 Grad über der GLO-Editionstemperatur des Polymers erhitzt wird.

Diese wird dann mit einer weiteren Metallplatte abgedeckt und dann auf etwa etwas zwischen zwei 50 und 500 PSI gepresst, was gut ist. Nach fünf Minuten können wir den Druck ablassen und die PLAs entfernen. Das lassen wir etwas abkühlen und dann werden die beiden Platten manuell getrennt und die Form vom Substrat gelöst.

So sieht das Substrat aus. Nach dem Lösen aus der Form bohren wir 1,5 Millimeter große Löcher an den Enden des Kanals, die als Einführ- und Sammelbrunnen dienen. Und dieses geprägte Substrat wird dann mit einem anderen glatten Stück Kunststoff thermisch verbunden, um mikrofluidische Merkmale zu formen und zu schließen.

Beide Teile werden so auf die Herdplatte geklebt. Die Temperatur wird auf die Glasationstemperatur des Polymers reduziert, die 136 Grad Celsius beträgt. Auch für den thermischen Klebeprozess werden die Metallplatten in die Heißpresse gelegt, die auf die Glasübergangstemperatur von 136 Grad Celsius erhitzt wird und bei zwei 50 PSI zwei Minuten lang zusammengepresst wird.

Bei der Glasübergangstemperatur beginnt das Polymer zu schmelzen und miteinander zu verschmelzen, und so erhalten wir geschlossene mikrofluidische Merkmale. Nach zwei Minuten wird der Druck abgelassen. So sieht das endgültige mikrofluidische Gerät mit den geschlossenen Kanälen und den Zugangsöffnungen für die Probeneinführung und -entnahme aus. Wir bereiten nun die Mikrokanäle für die Bildung des porösen Polymermonolithen vor.

Der erste Schritt dieses Prozesses ist ein Veredelungsprozess. Wir ändern die Oberflächenchemie der Mikrokanäle und der Xan X six 90 R-Plattform. Dies ist notwendig, damit wir eine kovalente Bindung des porösen Polymermonolithen innerhalb des Mikrokanals haben können.

Bei dieser Oberflächenmodifikation handelt es sich um einen Transplantationsprozess, bei dem EDA zu MMA mit einem Photoinitiator Benzo-Phänotyp eins zu eins ausgetauscht wird. Was ich hier also mache, ist eine Eins-zu-Eins-Konzentration von MMA und EDA zur Lösung. Ich füge 3% Benza-Phänotyp hinzu, damit wir diesen Monolithen innerhalb des Kanals vernetzen können.

Sobald die Pfropflösung gemischt wurde, spritzen wir diese in den Mikrokanal und füllen den Kanal aufgrund der Kapillarwirkung. Sobald der Kanal gefüllt ist, geben wir diesen in einen UV-Vernetzer und dieser wird 10 Minuten lang mit einem Energieniveau von 200 Millijoule pro Quadratzentimeter vernetzt. Nach den 10 Minuten der UV-Belichtung werden die Pfropflösung und der Mikrokanal mit Methanol gespült, wobei dieses mit Vakuumaspiration verwendet wird.

Was ich hier also tun werde, ist, Methanol mit einem Vakuum an einem Ende des Kanals zu platzieren und den Kanal mit Methanol zu spülen. Dies dient dazu, überschüssige Lösung zu entfernen, die nicht polymerisiert wurde. Dies ist ein Vergleich von Cyclo, Ethanol und Cyclin, alle mit den Kohlenstoffnanoröhren in einer Konzentration von 2,27 molaren.

Das Cyclin mit Kohlenstoffnanoröhren wird für eine gleichmäßige Dispersion der Kohlenstoffnanoröhren innerhalb der Lösung ausgelegt. Nach dem Pfropfprozess wurde die Oberflächenchemie modifiziert und ist nun bereit für eine feste Befestigung des Monolithen innerhalb des Mikrokanals. Nun beschreibe ich die Entstehung des Kohlenstoff-Nanoröhren-Monolithen VICIS.

Dieser setzt sich aus Genen, Lösungsmitteln und Monomeren zusammen. Die vier Elemente, die an diesem Prozess beteiligt sind, sind Al-zu-Ecol, Butylmethacrylat und EDMA. Zusätzlich fügen wir einen Photoinitiator hinzu, damit wir den Monolithen in Sotu mit Hilfe einer UV-Polymerisation formen können.

Ich werde eine Probe von hundert Mikrolitern machen. Ich pipettiere 52,5 Mikroliter ecol. Dies muss langsam erfolgen, da ecol viskos ist.

Nach dem Ecol fügen wir die Kohlenstoffnanoröhren mit Cycloanol hinzu. Dies muss einige Minuten lang kräftig vortext werden, um eine korrekte Verteilung zu gewährleisten. Auch hier müssen wir die Cycloandal- und Kohlenstoffnanoröhren langsam pipettieren, da es sich um eine Abicus-Lösung handelt.

Dann fügen wir 15 Mikroliter Butylmeth Aly hinzu. Und zum Schluss fügen wir 10 Mikroliter EDMA hinzu. Wir werden das kurz wirbeln, unseren Fotoinitiator hinzufügen und dann beschallen.

Der Photoinitiator, den wir hinzufügen, ist DM PAP zum Lysemonolithen. Diese wird in einer Konzentration von 1,13 zum Gesamtvolumen dieser hundert Mikroliter fassenden Lösung zugegeben. Da es sich um einen Fotoinitiator handelt, möchten wir nach dem Hinzufügen unsere monolithische Lizenzlösung abdecken, um sicherzustellen, dass während der Beschallung keine Belichtung erfolgt.

Dieser wird 30 Minuten lang bei einer Amplitude von 50 % und einem Tastverhältnis von 50 % geschlagen. Diese Einschaltdauer von 50 % dient dazu, eine Überhitzung der Lösung zu vermeiden. Es ist äußerst wichtig, die Lösung nach der Beschallung einzunehmen und schnell zu arbeiten.

Dies liegt daran, dass wir eine gleichmäßige Verteilung der Kohlenstoffnanoröhren in der Lösung sicherstellen möchten, da wir die Lösung in den Mikrokanal pipettieren werden. Hier haben wir die Lyselösung. Gleich nach der Sonifikation und sehr schnell arbeiten pipettieren wir das Volumen mit Kapillarwirkung in den Mikrokanal, es fließt in den Kanal.

Diesen geben wir für 0,9 Minuten bei einem Energieniveau von 120 Millies pro Quadratzentimeter in den Vernetzer. Nach diesen 0,9 Minuten drehen wir das Gerät um. Dieses Flipping dient also im Wesentlichen dazu, eine gleichmäßigere Polymerisation und eine gleichmäßigere Verteilung der Kohlenstoffnanoröhren im Kanal zu ermöglichen.

Sobald der Monolith polymerisiert und mit Methanol, der Monomerlösung, gespült wurde, wird das Innere des Monolithen nicht mehr klar sein, sondern ein leuchtendes Weiß, es werden winzige schwarze Flecken übrig bleiben, die die Kohlenstoffnanoröhren im Monolithen sein werden. Der Festphasenextraktionsmonolith wird auf ähnliche Weise wie die Kohlenstoffnanoröhre, die Lyse und der Monolith hergestellt. Dies ist die Bakterien- und Flüssigkultur, und hier haben wir eine Probe unserer Medien.

Sobald wir die Probe verdünnt haben, pipettieren wir sie in einen Tierarzt und zentrifugieren sie. Anschließend dekantieren wir das Medium, wobei wir darauf achten, dass das Bakterienpellet an der Seite des Einor-Rohrs nicht gestört wird. Dann werden die Bakterien in einer Lösung mit gudo, dium, thio, SDS und Protease K resuspendiert. Das pipettierte gu diem thiocyanat hat das gleiche Volumen, in dem das Bakterium suspendiert wurde.

Hier wurden die Bakterien in einer mil suspendiert, daher werde ich die Bakterien in einer mil gguumm thiocyanat zum gu thiocyanat resuspendieren. Ich füge Proteinase K hinzu, ich füge 45 Mikroliter und RNAs hinzu. Die letzte Lösung, die ich hinzufüge, ist SDS.

Danach ist die Lösung ein Wirbel. Nach dem Vortexen pipettieren wir die Bakterienprobe in eine Einwegspritze. Hier verwenden wir eine drei mil Excel Einwegspritze.

Dieser verfügt über einen Köderanschluss, der mit dem Peak-Schlauch verbunden wird, und wir werden ihn über Nano-Ports mit unserem Gerät verbinden. Also werde ich die Lösung in die Einwegspritze pipettieren. Wir wollen absaugen, um sicherzustellen, dass sich keine Luft im System befindet.

Du willst das so lange tun, bis ein oder zwei Tropfen aus dem anderen Ende kommen. Jetzt, da wir unsere Lösung für den Anschluss an unser Gerät bereit haben, platzieren wir unsere Einwegspritze auf unserer KDS-Spritzenpumpe und verbinden das Ende unserer Armatur mit unserem Lizenzgerät, das über Nano-Ports verfügt, die wir an jedem Ende mit einem EP versehen haben. Dies ermöglicht eine feste Verbindung mit dem Gerät.

Dabei handelt es sich um Verschraubungen, und in der Regel kleben wir das Gerät gerne fest, um sicherzustellen, dass es nicht umkippt. Hier stellen wir die Durchflussmenge auf vier oder fünf mil pro Stunde ein. Dabei handelt es sich um eine Verdrängerpumpe, die die Lösung durch die Spritze, durch den Schlauch in diese Verbindung durch den Kanal drückt.

Und wir werden die Probe über diesen Nano-Ausgangsport sammeln. Wir können den Schadstoff mit einer Pipette sammeln, und dieser Schadstoff wird durch die nächste Phase geleitet, den Festphasenextraktionsprozess, um die bakterielle DNA für die Isolierung der Nukleinsäuren zu isolieren. Die feste Phase, die die Kieselsäurepartikel enthält, wird mit Guad Theo Signat enthaltendem Lysepuffer konditioniert.

Dies geschieht, indem eine Spritze mit dem Lysepuffer gefüllt und an der Spritzenpumpe befestigt wird, und der Puffer wird mit einer Durchflussrate von 300 Mikrolitern pro Stunde durch den Kanal geleitet. Es folgt die Beladung der Probe. Bei der Probe handelt es sich hier um das bakterielle Zelllysat, das wir aus dem vorangegangenen Lyseschritt gewonnen haben.

Auch hier wird die Ladung, diese Probe wird drei Minuten lang mit einer Durchflussrate von 300 Mikrolitern pro Stunde geladen. Danach wird der Kanal mit 70% bei Ethanol gewaschen, wiederum mit einer Durchflussmenge von 300 Mikrolitern pro Stunde. Dieser Waschschritt entfernt alle absorbierten Proteine und Verunreinigungen, und der Abfall wird aus der Sammlung gesammelt.

Nun, verwenden Sie nach dem Waschschritt eine Pipette, die alle Verunreinigungen entfernt. Die DNA, die an die Kieselsäure gebunden war, wird dann in Wasser eluiert. Das ist also eine Spritze, die wirklich Wasser zum Gießen enthält.

Es wird an dem Chip befestigt und wieder wird das Wasser mit einer Durchflussrate von 300 Mikrolitern pro Stunde durchströmt, und wir sammeln die Probe am anderen Ende. Dies geschieht drei Minuten lang, und wir sammeln 15 Mikroliter Ient, das ist reine DNA in Wasser, und ist PCR-bereit für die Herstellung des thermoplastischen Geräts. Die größte Herausforderung ist der Aspekt der thermischen Verklebung, da die Verklebung bei einer sehr hohen Temperatur erfolgt, bei oder in der Nähe der Glasübergangstemperatur des Polymers, wobei etwas Druck ausgeübt wird und eine leichte Variation des Drucks oder der Temperatur den Kanal vollständig auslöschen oder eine schlechte Abdichtung zwischen den beiden Kunststoffteilen erzeugen kann.

Daher ist es sehr wichtig, die optimale Temperatur und den optimalen Druck aufrechtzuerhalten, und es kann eine kleine Herausforderung sein. Die Schlüsselelemente, die in diesem Prozess eine Herausforderung darstellen, sind eine gleichmäßige Verteilung der Kohlenstoffnanoröhren in der Monomerlösung, die in situ UV-polymerisiert wird. Dies ist auch eine ähnliche Herausforderung wie eine gleichmäßige Dispersion der Kieselsäurepartikel im porösen Polymermonolithen für die Festphasenextraktion.