المانعة الذاتي تجميعها Monolayers على Microelectrodes عن جزيئات حيوية الزخرفه

Summary

نقدم إجراء لتشكيل البولي (جلايكول الإثيلين) أحادي الطبقة تجميع الذاتي (PEG سام) على ركيزة من السيليكون مع microelectrodes الذهب. يتم تشكيل PEG - SAM في خطوة واحدة ، ويمنع على السطوح biofouling السليكون والذهب. ثم يتم استخدام الجزيئات الحيوية الكهربائي عن الزخرفة وصولا الى النانو.

Abstract

نقدم إجراء لتشكيل بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) trimethoxysilane الذاتي تجميعها أحادي الطبقة (SAM) على ركيزة السيليكون مع microelectrodes الذهب. يتم تشكيل PEG - SAM في خطوة واحدة ويمنع التجمع biofouling على الأسطح السيليكون والذهب. يتم استخدام SAM إلى معطف microelectrodes منقوشة مع معيار الطباعة الحجرية لهجة إيجابية. باستخدام أنيبيب كمثال ، ونحن نطبق الجهد العاصمة للحث على الهجرة إلى القطب الكهربي SAM المغلفة بطريقة عكسية. ويستخدم غرفة للتصوير تدفق الهجرة الكهربي والزخرفة أنيبيب

Protocol

إعداد الكواشف

إعداد أنابيب العازلة (أنابيب 80 ملم ، 1MM MgCl ₂ ، 1MM EGTA ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 6.8 مع KOH). قسامة وتخزين أوكسيديز الجلوكوز ، والجلوكوز في الكاتلاز -70 درجة مئوية ، والتاكسول على -20 درجة مئوية وفقا للبروتوكولات القائمة. ^1،2 قسامة وتويولين المحل في -70 درجة مئوية وفقا للتعليمات التي أدرجها المورد.

نمط microelectrodes الاتحاد الافريقي باستخدام الطباعة الحجرية

1. قطع رقائق السليكون الى ركائز 1 سم "1.5 سم به كاتبا أو قطع رقاقة. تنظيف ركائز عن طريق وضعها في كوب مع الأسيتون يكفي لتغطيتها ويصوتن لمدة 5 دقائق. دون السماح للركائز لتجف ، وشطف لهم في الأسيتون الطازجة ، ثم يشطف فورا في الأيزوبروبانول والجافة باستخدام النيتروجين.
2. افتعال microelectrodes الاتحاد الافريقي على ركائز النظيفة باستخدام معيار ، سواء كان إيجابيا أو لهجة ضوئيه الإلكترون الطباعة الحجرية شعاع ، اعتمادا على حجم من الميزات المطلوبة. ³ عند تصميم نمط الهندسة ، والحفاظ على كل قطرة نمط الكهربائي أقل من 100 ميكرون لضمان التغطية من قبل PEG SAM (وصفها في المقطع التالي). وتشمل منصات الاتصال (~ 300 ملم ²⁾ المتمركزة 300-500 ملم من نمط بخط 1 ملم يربط لوحة مع القطب (الشكل 1). وضع أنماط الطباعة الحجرية بالقرب من منتصف الركيزة للسماح الفضاء حول نمط لتجميع غرفة التدفق.
   
   الشكل 1. هندسة نموذج. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
3. بعد تطوير نمط في طبقة مقاومة ، خط الصفر في مقاومة من منصة اتصال لحافة الركيزة باستخدام الملقط (الشكل 1). عند ترسب المعادن ، وسوف تسمح الصفر الاتصال الكهربائي بين القطب وحافة الركيزة. ويستخدم غرفة الترسيب ، ويفضل أن يكون مع اثنين من المصادر ، على أن تودع طبقة معدنية. وتشكل الأقطاب التي ترسب من 2 نانومتر من الكروم (للالتصاق) ، يليه 6 نانومتر للاتحاد الافريقي ، من دون كسر الفراغ. ويمكن استخدام microbalance الكريستال الكوارتز داخل غرفة مجهزة لقياس سماكة من الأفلام خلال الترسيب.

تحضير SAM

1. وتسخين الفرن في منطقة جيدة التهوية إلى 75 درجة مئوية. إعداد الحل silanization بإضافة 20 مل من التولوين إلى الدورق الزجاجي 250 مل. ثم يضاف 1 مل الربط بين سيلاني (أي 5 ٪ V / V) إلى التولوين باستخدام ماصة بلاستيكية. مزيج جيد في الربط بين سيلاني من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 10 مرات ، ثم مع التحريك ماصة لمدة 30 ثانية.
2. وضع عينات منقوشة في الدورق مع الجانب منقوشة تواجه صعودا ، والتأكد من أنها هي غارقة تماما في حل الربط بين سيلاني التولوين ومتباعدة بشكل متساو عبر قاع الكأس. ضع الكأس في الفرن واخبزيها 18-21 ساعة عند 75 درجة مئوية. بينما يتشكل SAM ، وإعداد counterelectrode (أنظر أدناه) ، وتجميع أي مكونات إضافية المطلوبة لتنفيذ الخطوات المتبقية.
3. بعد 18-21 ساعة في الفرن ، يجب أن تتبخر تاركة التولوين عينات منقوشة في الربط بين بقايا سيلاني اللزجة. إضافة 20 مل من التولوين إلى الدورق ونقع العينات لمدة 1-2 دقائق. إزالة عينات من الدورق وشطف مع التولوين ، ثم الأيزوبروبانول ، والجافة وأخيرا مع النيتروجين. في هذه النقطة ، يجب أن العينات تبدو نظيفة وطبقة ينبغي SAM غير مرئية للعين المجردة. أعد صواريخ سام بهذه الطريقة يمكن استخدامها لمدة تصل إلى يومين عند تخزينها تحت ظروف بارد وجاف (25 درجة مئوية والرطوبة المعتدلة). نتائج ناجحة في تشكيل SAM بقايا طلاء ملون الغائمة أو غير متساو على السطح.

يلفقون counterelectrode

ترسب في إعداد غرفة نفسها التي استخدمت لترسب microelectrode ، وجعل counterelectrode بإيداع 1 نانومتر من الكروم ، تليها 4 نانومتر للاتحاد الافريقي في الصعود إلى 22 × 50 مم رقم 1 أو رقم ساترة الزجاج 0. ينبغي أن تكون شفافة counterelectrode تقريبا مع صبغة رمادي فاتح أو الوردي. تخزين counterelectrode المغلفة جانب المتابعة في طبق بتري للحفاظ على نظافتها.

تتبلمر تويولين إلى MTS

1. ذوبان الجليد وغير المسماة تويولين تويولين رودامين والجمع على الفور في نسبة 01:02 المسمى لغير المسماة في الحصول على MTS مشرق. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. وتتبلمر تويولين عن 20-40 دقيقة في حمام ماء ساخن عند 37 درجة مئوية. سوف طول MTS تكون أكبر لأوقات أطول البلمرة. بينما هو تويولين البلمرة ، وإعداد أنابيب العازلة - التاكسول بإضافة التاكسول إلى 20 ملي في أنبوب microcentrifuge تحتوي أنابيب العازلة. مزيج جيد من قبل التاكسول pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات وvortexing ، ثم ضع الأنبوب في حمام ساخن في 37 درجة مئوية. بعد البلمرة ، تمييع MTS بنسبة 100 / 1 في أنابيب العازلة - التاكسول الدافئ والدرعبعيدا عن الضوء. سوف MTS أعدت في هذا السبيل على مر الزمن واستطال حزمة ، والتي يمكن تقليصها من خلال تخفيف أخرى.
2. تحضير مزيج الأكسجين 10X الكسح (OS) عن طريق الجمع بين 30 مل أنابيب العازلة الباردة (0-4 درجة مئوية) ، و 5 مل من 50 ٪ 2 - المركابتويثانول ، 5 أوكسيديز الجلوكوز مل ، 5 مل الكاتلاز ، و 5 مل من السكر. ⁽²⁾ الجلوكوز وينبغي أن يضاف الماضي. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات بعد إضافة كل عنصر. مكان الخليط OS على الجليد ، وسوف تبقى فعالة لحوالي 2 ساعة.
3. تحقق من أن البلمرة MT كانت ناجحة وأن النظام التجاري المتعدد الأطراف ومستقرة في ظل عدة دقائق من الإثارة التي مضان التصوير MTS أعدت مع مزيج OS 1X. لتصوير النظام التجاري المتعدد الأطراف على استعداد في هذا السبيل ، تأكد من استخدام مزيج الإثارة / الانبعاثات مناسبة لتصفية رودامين مضان. تحديد العمل من أجل التخفيف أفضل شعيرات التصوير الفردية عن طريق تمييع MTS زيادة بنسبة 10 / 1 إلى 1 / 100 باستخدام أنابيب عازلة والتصوير مع مزيج OS 1X.
4. تعد الغرفة التي يقحم تدفق كبير (22 × 50 ملم) والصغيرة ساترة الزجاج (22 × 22 ملم) مع اثنين من قطعة من الشريط على الوجهين وضعت 2-3 مم إربا. يتم قطع الشريط بسهولة إلى شرائح بوضعها على شريحة زجاجية وقطع بشفرة حلاقة. إدخال قليل من microliters MTS في الخلية التدفق باستخدام micropipette. التكبير للتصوير عالية ، قد تكون هناك حاجة أهداف العمل الطويلة المسافة للتصوير السطح العلوي للغرفة التدفق. يتم تحديد المسافة من سطح ساترة / العينة إلى السطح العلوي للغرفة عن طريق تدفق سمك الشريط ، وينبغي 6-10 ملم.

نمط MTS باستخدام الكهربائي

1. تعد الغرفة الكهربائي عن طريق وضع قطعتين رقيقة من الشريط على الوجهين عبر العينة منقوشة ، SAM المغلفة بحيث الكهربائي بين شرائح الاتصال مع المسار تشغيل عمودي على الشريط (الشكل 2). ضع counterelectrode على الشريط على الوجهين مع الجانب المعادن لمس الشريط بحيث يتدلى حافة العينة التي counterelectrode حوالي 3 ملم (الشكل 2). قطع عدة أطوال 15 سم من الأسلاك النحاسية المعزولة والشريط المغناطيس 1 سم من العزل الخروج من كلا الطرفين. إرفاق سلك الاتحاد الافريقي الى المنطقة المكشوفة من الركيزة باستخدام قطرة صغيرة من الطلاء الفضة مع الحرص على تجنب الوقوع في الاتصال مع counterelectrode الكهربائية (يمكن التحقق من ذلك مع المتعدد). إرفاق السلك الثاني للcounterelectrode باستخدام الطلاء الفضة. ويمكن طلاء الأسلاك المرفقة مع مزيد من الفضة المضمون للعينات مع الشريط.
   
   تدفق خلية الرقم 2. التجمع من أجل an مضان المجهر المقلوب. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.
2. أعرض MTS في التخفيف المطلوب باستخدام أنابيب العازلة جنبا إلى جنب مع نظام التشغيل في تركيز 1X النهائي. الصور 20X في التكبير وتحديد نمط على رقاقة السيليكون قبل تطبيق الجهد. اختياريا ، يمكن اغلاق غرفة تدفق استخدام طلاء الأظافر لمنع تدفق السوائل والهجرة طن متري في الطائرة من غرفة التدفق.
3. تطبيق الجهد حتى 1 الخامس ومراقبة الهجرة من MTS. ويمكن استخدام أقل الفولتية (وصولا الى نحو 0.5 V) إذا كان هو المطلوب محاصرة عكسها من MTS ، ولكن هذا يتطلب ختم الغرفة لمنع تدفق الانحراف الجانبي. طلاء الأظافر يعمل بشكل جيد لمنع تسرب نهايات مفتوحة للغرفة التدفق. في الفولتية فوق حوالي 0.7 V ، قد شهد بعض التصاق طن متري على نمط ، على الرغم من أنها ستكون ضعيفة. في الفولتية أعلاه نحو 0.9 V ، فإن الهجرة MT يكون أسرع ، والتصاق ستكون أقوى. V 1.2 أعلاه حول احتمال للحمل الكهربائي (تشكيل فقاعة غاز) ، وكذلك عن تدمير microelectrodes بشكل ملحوظ. يمكن تتبع الهجرة عن طريق ضبط الطائرة العمودية التي تركز عليها المجهر. إذا ما نفذت بشكل صحيح ، فإن النظام التجاري المتعدد الأطراف في توطين السطوح الكهربائي.

Discussion

بسهولة هجرة MTS تصور باستخدام المجهر مضان بسبب لمعانها ومضان خلفية منخفضة. هذه الطريقة تنطبق عموما على الزخرفة جزيء حيوي ، لأنه لا يتطلب سوى أن يكون ذلك حافزا على الجزيئات الحيوية لتحمل شحنة من صافي تسوية مناسبة للدرجة الحموضة عازلة. يتم تجنب Electroosmosis في هذا الإعداد لأنه لا توجد اتهامات السطوح مثل الجدران السيليكا المستخدمة في الكهربائي الشعري.

تعديلات عدة من هذا الأسلوب ممكنة. الختم ينتهي من غرفة تدفق أمر بالغ الأهمية لمراقبة عكس بسبب التبخر من تاريخ فتح معظم أسباب تدفق السوائل وغير مرغوب فيه الهجرة طن متري. سوف أكسدة رقاقة السيليكون قبل الزخرفة الحجرية منع التوصيل من خلال الركيزة ، والسماح لأقطاب متعددة مع إمكانات مستقلة لاستخدامها في وقت واحد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.