Summary
我们目前与金微电极的硅衬底上形成一个聚乙二醇（PEG）自组装单层膜（PEG - SAM）的一个过程。 PEG - SAM是形成了一个步骤，并防止在硅和金表面的生物污染。电泳是用于图案的生物分子到纳米级。
Abstract
我们目前与金微电极的硅衬底上形成一聚乙二醇（PEG）的三甲氧基硅烷自组装单层膜（SAM）的一个过程。 PEG - SAM是形成一个单一的装配步骤，防止在硅和金表面的生物污染。 SAM是用来与标准，积极音光刻图案的大衣微电极。微管作为一个例子，我们应用诱导电泳迁移到一个可逆的方式SAM涂层电极直流电压。甲流室是用于成像的电泳迁移和微管的图案
Protocol
试剂的制备
准备管道的缓冲液（80毫米的管道，1MM氯化镁2，为1mM EGTA，用KOH调节pH至6.8）。分装和储存葡萄糖氧化酶，过氧化氢 酶和葡萄糖在-70 ° C和紫杉醇在-20 ° C根据现有的协议。1,2分装和存储微管蛋白在-70 ° C，根据供应商包括的指示。
图案的金微电极使用光刻
- 切成1厘米，1.5厘米，用抄写员或晶圆切割机基板的硅晶片。他们有足够的丙酮，在烧杯中，以支付他们，超声5分钟的清洁基板。而不让基板干燥，新鲜丙酮冲洗，然后立即在异丙醇和干燥使用氮气冲洗。
- 工房金微电极的清洁基板上使用的标准，积极音光刻或电子束光刻，根据所需的功能的大小3当设计模式的几何形状，保持直径100微米以下的每个电极图案覆盖，以确保聚乙二醇的SAM（在下一节中描述）。包括接触片（〜300毫米2）从300到500毫米1毫米的电极垫（图1）连接线的格局定位。基板中间附近的平版印刷的图案，让周围的组装流室的格局空间。
图1。样品的几何形状。请点击这里看到图1的放大版本。 - 在光阻层的模式发展后，从头开始在抵制从接触垫的使用镊子（图1）基板的边缘线。从头金属沉积后，将使电极与基板边缘之间的电接触。沉积室，最好是有两个来源，是用来沉积的金属层。其次为6纳米的金，不破坏真空的情况下，沉积的Cr 2纳米（粘连）所形成的电极。箱内配备石英晶体微量天平，可用于测量薄膜的厚度在沉积过程中。
准备的SAM
- 预热烤箱在通风良好的区域为75 ° C准备一个250毫升的玻璃烧杯加入20 mL甲苯的硅烷化解决方案。然后加入1毫升的PEG -硅烷（即5％V / V）甲苯，用塑料吸管。 PEG硅烷吹打高达5至10倍，然后用30秒的吸管搅拌混合。
- 烧杯图案的一面朝上放置在图案的样品，确保它们完全淹没在PEG硅烷的甲苯溶液，并均匀地分布在烧杯底部间隔。烧杯放置在烤箱和烘烤18至21小时，在75 ° C。虽然SAM正在形成，准备counterelectrode（见下文）和组装中的其余步骤所需的任何额外的元件。
- 在烘箱中18-21小时后，甲苯挥发一种粘稠的PEG -硅烷残渣留在图案的样本。加入20 mL甲苯烧杯中，浸泡1-2分钟的样品。从烧杯中取出样品，用甲苯，然后异丙醇冲洗，最后用氮气干燥。此时，样品应显得干净和SAM层应该是肉眼看不见的。地空导弹准备这两天使用，储存在阴凉干燥条件下（25℃，湿度适中）。 SAM在阴天或不均匀斑驳陆离残留涂层表面上形成的不成功结果。
编造的counterelectrode
在同一沉积室设置用于微电极沉积，沉积1 nm的铬，4纳米金上一个22 × 50毫米的1号或0号玻璃盖玻片counterelectrode。 counterelectrode应接近透明的浅灰色或粉红色的色调。商店在培养皿counterelectrode涂层朝上，以保持清洁。
到MTS的聚合微管蛋白
- 解冻未标记的微管蛋白和罗丹明微管蛋白，并立即贴上标签，无标签，以获得明亮的微管在1:2的比例结合。混合移液器向上和向下几次。在恒温水浴20-40分钟的微管蛋白聚合，在37 ° C。多边贸易体制的长度将是更大的聚合时间较长。虽然微管蛋白聚合，准备加入到含有微量管道的缓冲区管的紫杉醇20毫米的一个管道紫杉醇的缓冲区。紫杉醇混合移液器向上和向下几次震荡，然后放入加热浴管在37 ° C。聚合反应后，1 / 100稀释的MTS在暖管道紫杉醇缓冲区和盾由轻。在这种方式准备的MTS将拉长随着时间的推移和捆绑，它可以减少被进一步稀释。
- 准备30毫升冷管道的缓冲区（0-4℃），5毫升50％2 -巯基乙醇，5毫升5毫升的葡萄糖氧化酶，过氧化氢 酶，和5 mL葡萄糖结合了10倍的氧气清除混合物（OS） 。葡萄糖应该是最后添加。混合吹打后加入每个组件向上和向下的3-5倍。操作系统的混合物置于冰上;将保持约2小时有效。
- 验证吨聚合是成功的，多边贸易体系的稳定1X操作系统组合的准备微管成像的荧光激发下几分钟。成像，这种方式准备了MTS，一定要使用适合罗丹明荧光激发/发射滤波器组合。确定进一步稀释1 / 10到1 / 100使用1X操作系统组合的管道缓冲区和成像的MTS个人细丝成像的最佳工作稀释。
- 准备一个流室，夹两片双面胶带分开放置2-3毫米的一个大（22 × 50毫米）和小（22 × 22毫米）的玻璃盖玻片。磁带很容易切成条状，放在载玻片上，并用刀片切割。引入流使用微量的细胞MTS的几个微升。对于高放大倍率的成像，长工作距离的目标可能需要成像的上表面流室。从盖玻片/样品表面的距离上表面流室是由磁带的厚度，应60-100毫米。
图案MT的使用电泳
- 准备通过将整个图案，SAM涂层样品，电极之间的连接路径到磁带上（图2）垂直的条两个细条双面胶带电泳室。与金属的一面触摸磁带等counterelectrode放在双面胶带，约3毫米（图2）样品出挑的counterelectrode的边缘。切几个15厘米的绝缘铜线的长度和钢带两端的1厘米的保温。将电线外露的金基板面积的使用银粉漆的小降，同时注意避免使电气接触与counterelectrode（这可以用万用表检查）。将第二线counterelectrode使用银粉漆。银漆连接线，可以进一步固定用胶带样品。
图2。流倒置荧光显微镜下的细胞大会。请点击这里看大图图2。 - 使用管道缓冲区1X终浓度与操作系统相结合，在所需的稀释介绍MTS。在20倍的放大倍率图像和定位在施加电压的硅晶片上的图案。 （可选），流室，可密封使用指甲油，以防止流体流动和流室的平面MT迁移。
- 申请高达1伏的电压，并观察MTS的迁移。如果可逆捕获所需的MTS，可用于低电压（下降约0.5 V的），但是这需要密封，以防止横向漂移流室。指甲油密封流室的开放结束。在约0.7 V以上的电压，可能会看到一些吨粘附上的图案，虽然这将是微弱的。在电压约0.9 V以上，吨迁移将更快，粘连会更强。约1.2伏以上的诱导电解（气泡的形成）和破坏的微电极的可能性大大增加。迁移可以跟踪通过调整显微镜的焦点垂直平面。如果正确执行，MTS将在电极表面的本地化。
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Discussion
MTS的迁移是很容易的可视化使用，因为它们的亮度和低背景荧光的荧光显微镜。方法一般适用于生物分子的图案，因为它仅需要诱导的生物分子进行适当的调整缓冲液pH值的净电荷。电渗是避免在此设置，因为有没有收取的表面，如毛细管电泳中使用的硅墙壁。
这种方法的若干修改是可能的。密封流室的两端是至关重要的观察，因为从开完的蒸发导致散装流体流动和不良吨迁移的可逆性。氧化硅晶片光刻图案前将阻止通过基板的传导，允许多个电极，同时使用的独立潜力。
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Acknowledgments
我们承认梅利莎Grunlan SAM的形成有益的讨论。这项研究是支持的，一部分由罗伯特A ·韦尔奇基金会（1585年）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1 |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Acetone | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS grade |
| Catalase | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzene | EMD Millipore | MK441908 | ACS grade |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glucose | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Glucose oxidase | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanosine-5’-triphosphate | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Isopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS grade |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paclitaxel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | molecular weight 950K |
| Rhodamine tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T331M | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
| Toluene | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS grade |
| Tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T238 | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies. |
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References
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
