Summary
우리는 황금 microelectrodes와 실리콘 기판에 폴리 (에틸렌 글리콜) 자기 조립 monolayer을 (PEG - SAM) 형성을위한 절차를 제시한다. PEG - SAM은 단일 단계에서 형성과 실리콘과 금색 표면에 biofouling을 방지합니다. 전기 영동은 다음 nanoscale patterning의 biomolecules에 대한 아래 사용되고 있습니다.
Abstract
우리는 금을 microelectrodes과 실리콘 기판에 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) trimethoxysilane 자기 조립 monolayer (SAM)을 형성을위한 절차를 제시한다. PEG - SAM은 단일 어셈블리 단계에서 형성과 실리콘과 금색 표면에 biofouling을 방지합니다. SAM은 표준 긍정적인 톤 리소그래피로 패턴 외투 microelectrodes하는 데 사용됩니다. 예를 들어 미세 소관을 사용하여, 우리는 되돌릴 방법으로 SAM - 코팅 전극에 전기 마이 그 레이션을 유도하는 DC 전압을 적용합니다. 흐름 챔버은 이미징을위한 전기 마이 그 레이션 및 미세 소관의 patterning을 사용합니다
Protocol
시약의 준비
파이프 버퍼 (코와 산도 6.8로 조정 80 MM 파이프, 1mM MgCl 2, 1mM EGTA) 준비. -70에서 나누어지는 및 매장 포도당 산화 효소, 카탈 라 아제 및 포도당 -20 ° C에서와 taxol ° C 기존의 프로토콜에 따라. -70에서 1,2 나누어지는 및 매장 tubulin ° C 공급자에 포함된 지시에 따라.
리소그래피를 사용하여 패턴 오 microelectrodes
- 학자 또는 웨이퍼 커터를 사용하여 1cm '1.5 cm 기판으로 실리콘 웨이퍼를 자르고. 그들을 커버하고 5 분 sonicate 정도 아세톤있는 비커에서 그들을 배치하여 기판을 청소하십시오. 기판 건조 수 있도록하지 않고, 신선한 아세톤에서 그들을 씻어 후 즉시 이소프로판올 건조 질소로 사용 린스.
- 원하는 기능의 크기에 따라, 표준, 긍정적인 톤 석판술이나 전자빔 리소그래피를 사용하여 깨끗한 기판에 오 microelectrodes를 조작. 3 패턴 지오메 트리를 디자인할 때,의 범위를 보장하기 위해 100 미크론 아래의 각 전극 패턴의 직경을 유지 PEG SAM (다음 섹션에서 설명). 전극 (그림 1)과 패드를 연결하는 1mm 라인 패턴에서 500 mm까지 300 위치 연락처 패드 (~ 300mm 2) 포함합니다. 흐름 챔버를 조립을위한 패턴 주위에 공간을 허용하도록 기판의 중앙 근처에 리소그래피 패턴을 놓으십시오.
그림 1. 샘플 기하학. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. - 저항 층의 패턴을 개발 후, 접촉 패드에서 핀셋을 (그림 1)를 사용하여 기판의 가장자리에 저항의 라인을 긁어. 금속 증착시, 스크래치는 전극과 기판의 가장자리 사이의 전기적 접촉을하실 수 있습니다. 선호 두 군데로 증착 챔버는, 금속 레이어를 입금하는 데 사용됩니다. 전극은 진공을 깨지 않고, 오 6 NM 다음 피크 2 NM의 증착 (유착)을 형성하고 있습니다. 챔버 내부에 장착되어 쿼츠 크리스털 microbalance는 증착 동안 필름의 두께를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
SAM 준비
- 앞서 열을 가하다과 75 환기가 잘되는 지역에 오븐 ° C. 250 ML 유리 비커에 톨루엔 20 ML을 추가하여 silanization 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 톨루엔 1 ML PEG - 실란 (예 : 5% V / V)를 추가합니다. 최대 pipetting 아래 5-10 회 후 30 초 동안 피펫과 감동하여 PEG - 실란 우물에 섞는다.
- 그들이 완전히 PEG - 실란 톨루엔 용액에 빠져들하고 균일하게 비커의 바닥에 걸쳐 간격 있는지 확인하고, 위쪽으로 직면하고있는 패턴 사이드와 비커의 패턴 샘플을 넣으십시오. 오븐에 비커를 놓고 75 18-21시간를 구워 ° C. SAM이 형성되는 동안 counterelectrode 준비 (아래 참조)과 나머지 단계에 필요한 추가 구성 요소를 조립.
- 오븐에 18-21시간 후, 톨루엔은 점성 PEG - 실란 잔여물의 패턴 샘플을 떠나 증발한다. 비커에 톨루엔 20 ML을 추가하고 1~2분에 대한 샘플을 만끽해보세요. 비커에서 샘플을 제거한 다음 톨루엔, 이소프로판올와 린스, 그리고 질소로 드디어 건조. 이 시점에서, 샘플은 깨끗하고 보여야하고 SAM 계층은 육안으로 보이지 않는해야합니다. 샘스 시원하고 건조 조건 (25 ° C, 적당한 습도) 아래에 저장하면 최대 두 일 동안 사용할 수있는이 방법을 준비했습니다. 표면에 흐린 또는 고르지 hued 잔류 코팅에 실패한 SAM 형성 결과.
counterelectrode를 조작
microelectrode 증착에 사용되는 동일한 증착 챔버 설정에서, 22 X 50mm 번호 1 번호 0 유리 coverslip에 오 4 NM 다음 피크 1 나노미터를 입금하여 counterelectrode합니다. counterelectrode는 밝은 회색 또는 분홍색 색조와 거의 투명해야합니다. 깨끗하게 유지하기는 배양 접시에 코팅 쪽 접속 counterelectrode를 저장합니다.
MTS로 중합 tubulin
- 해동은 tubulin과 rhodamine tubulin의를 레이블이 지정되지 않은 즉시 밝은 MTS를 얻기 위해 레이블이 지정되지 않은 위해 레이블 1시 2분의 비율로 결합되어 있습니다. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 섞는다. 37 온수 물을 욕조에 20~40분에 대한 tubulin을 중합 ° C. MTS의 길이는 더 이상 중합 시간에 대한 더 많은 것입니다. tubulin은 polymerizing이지만, 파이프 버퍼를 포함하는 microcentrifuge 관으로 20 mm까지 taxol을 추가하여 파이프 - taxol 버퍼를 준비합니다. 최대 pipetting 아래로 여러 번하고 vortexing하여 잘 taxol를 섞어 다음 37 온수 욕조에 튜브를 삽입 ° C. 중합 후, 따뜻한 파이프 - taxol 버퍼와 방패의 1 / 100 MTS를 희석빛과. 이런 방식으로 준비 MTS는 시간과 추가로 희석하여 줄일 수 번들을 통해 길어지다 것입니다.
- 30 ML 차가운 파이프 버퍼 (0-4 ° C), 2 - 메르 캅 토 에탄올 50 %, 카탈 라 아제 5 ML 포도당 산화 효소, 5 ML, 5 ML 포도당의 5 ML을 결합하여 10X 산소 청소부 혼합 (OS)를 준비합니다. 2 혈당 마지막으로 추가되어야합니다. 각 구성 요소를 추가한 후 3-5 시간을 pipetting 아래로 섞는다. 얼음에서 운영 체제 혼합 장소, 그것은 약 2 시간 동안 효과가 유지됩니다.
- MT 중합가 성공과 MTS는 영상 1X OS 믹스와 함께 준비 MTS에 의해 형광 여기의 몇 분 이내에 안정되는 것을 확인합니다. 이미징에 대해이 방법으로 준비 MTS는, rhodamine의 형광에 적합한 자극 / 방출 필터 조합을 사용해야합니다. 추가 1X OS 믹스와 파이프 버퍼와 이미징을 사용하여 10분의 1 1 / 100 MTS를 diluting하여 이미징 개별 필라멘트에 가장 적합한 작업 희석를 결정합니다.
- 양면 테이프 두 가지가 떨어져 2-3밀리미터를 배치와 함께 대형 (22 X 50mm)과 작은 (22 X 22mm) 유리 coverslip을 sandwiching하여 흐름 챔버를 준비합니다. 테이프는 쉽게 유리 슬라이드에 배치하고 면도날로 절단하여 스트립으로 절단됩니다. micropipette를 사용하여 흐름 세포에 MTS 몇 microliters을 소개합니다. 높은 배율 이미징 들어, 긴 작동 거리의 목표는 이미징 흐름 챔버의 위쪽 표면을 위해 필요할 수 있습니다. 흐름 챔버의 상단 표면에 coverslip / 샘플 표면에서 거리는 테이프의 두께에 의해 결정되며 60~1백밀리미터해야합니다.
패턴 MTS는 전기를 사용하는
- 전극이 테이프 (그림 2) 수직 실행 연결 경로로 스트립 사이의 이러한 패턴, SAM - 코팅 샘플에 걸쳐 양면 테이프 두 얇은 스트립을 삽입하여 전기 챔버를 준비합니다. 같은 테이프를 감동 금속 면을 양면 테이프에 counterelectrode를 놓고 그것에 대해 3mm (그림 2)에 의해 샘플 overhangs counterelectrode의 가장자리. 절연 구리 마그넷 와이어의 여러 15cm 길이를 잘라 양쪽의 절연의 1cm를 스트립. counterelectrode (이것은 멀티미터로 확인하실 수 있습니다)와 전기 접촉을 만드는 않도록주의하면서 실버 페인트의 작은 방울을 사용하여 기판의 노출된 오 영역에 철사를 연결합니다. 은색 페인트를 사용하여 counterelectrode에 두 번째 와이어를 연결합니다. 은색 페인트와 연결된 전선은 더욱 테이프와 함께 샘플을 확보할 수 있습니다.
거꾸로 형광 현미경을위한 그림 2. 플로우 셀 조립. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. - 1X 최종 농도에서 OS와 함께 파이프 버퍼를 사용하여 원하는 희석에서 MTS를 소개합니다. 20X 확대 이미지와 전압을 적용하기 전에 실리콘 웨이퍼에 패턴을 찾습니다. 선택, 흐름 챔버는 흐름 챔버 비행기에서 유체 흐름과 MT 마이 그 레이션을 방지하기 위해 손톱 폴란드 사용하여 봉인 수 있습니다.
- 최대 1 V로 전압을 적용하고 MTS의 마이 그 레이션을 관찰합니다. MTS의 가역 트래핑이 원하는 경우 낮은 전압 (아래 0.5 V로)을 사용할 수 있지만 이것은 측면 표류을 방지하기 위해 흐름 챔버를 씰링이 필요합니다. 매니큐어의 흐름 챔버의 열린 끝을 밀봉을 위해 잘 작동합니다. 0.7 V 이상의 전압에 대해에서 일부 MT 부착이 그것이 약한 것입니다 불구하고, 패턴을 볼 수 있습니다. 0.9 V 이상의 전압에 관한에서는 MT 마이 그 레이션이 빠르게되고, 접착력이 강한 것입니다. 약 1.2 V 위의 microelectrodes을 파괴 또한 유도 전기 (가스 기포 형성)과에 대한 가능성이 크게 높아집니다. 마이 그 레이션은 현미경의 초점의 수직 비행기를 조정하여 추적할 수 있습니다. 정확하게 수행하면 MTS는 전극 표면에 집중합니다.
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Discussion
MTS의 마이 그 레이션을 쉽게하기 때문에 그들의 밝기와 낮은 배경 형광의 형광 현미경을 사용하여 시각입니다. 그것은 biomolecules이 버퍼 산도의 적절한 조정하여 그물 요금을 휴대 유도해야합니다와 같은 방법은 일반적으로 생분자 patterning 적용됩니다. 이러한 모세관 전기 영동에 사용되는 실리카 벽으로 더 충전 표면이 없기 때문에 Electroosmosis이 설정에서 피할 수있다.
이 방법의 몇 가지 수정이 가능합니다. 흐름 챔버의 끝을 밀봉하면 오픈 끝에서 증발 대량 유체 흐름과 바람직하지 MT 마이 그 레이션을 발생하기 때문에 안팎이 없게 짠 천성을 관찰하는 것이 중요합니다. 리소그래피 patterning하기 전에 실리콘 웨이퍼의 산화를 동시에 사용할 수 독립 후보로 복수의 전극에 대한 수 있도록 기판을 통해 전도를 방지할 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 SAM 형성에 도움이 토론에 대한 멜리사 Grunlan을 인정합니다. 이 연구는 로버트 A. 웰치 재단 (A - 1585)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1 |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Acetone | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS grade |
| Catalase | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzene | EMD Millipore | MK441908 | ACS grade |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glucose | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Glucose oxidase | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanosine-5’-triphosphate | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Isopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS grade |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paclitaxel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | molecular weight 950K |
| Rhodamine tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T331M | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
| Toluene | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS grade |
| Tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T238 | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies. |
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References
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
