Summary
Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (Ethylenglycol) selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einem einzigen Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die Elektrophorese wird dann für die Strukturierung von Biomolekülen bis in den Nanobereich eingesetzt.
Abstract
Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (ethylenglycol) (PEG) trimethoxysilan selbstorganisierten Monoschicht (SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einer einzigen Versammlung Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die SAM ist die Beschichtung Mikroelektroden mit Standard-, Positiv-Ton-Lithographie strukturiert werden. Mit der Mikrotubuli als Beispiel verwenden wir eine Gleichspannung an elektrophoretische Migration auf die SAM-beschichteten Elektrode in einer reversiblen Weise zu induzieren. Eine Flusskammer ist für die Bildgebung der elektrophoretischen Migration und Mikrotubuli-Strukturierung eingesetzt
Protocol
Vorbereitung der Reagenzien
Bereiten PIPES-Puffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, eingestellt auf pH 6,8 mit KOH). Aliquotieren und lagern Glucose-Oxidase, Catalase und Glucose bei -70 ° C und Taxol bei -20 ° C nach den bestehenden Protokollen. 1,2 aliquotieren und lagern Tubulin bei -70 ° C gemäß den Anweisungen des Lieferanten enthalten.
Pattern Au-Mikroelektroden mit Lithographie
- Cut Silizium-Wafern in 1 cm '1,5 cm Substrate mittels eines Stifts oder einer Wafer-Cutter. Reinigen Sie die Substrate, indem man sie in ein Becherglas mit ausreichend Aceton um sie zu bedecken und beschallen für 5 Minuten. Ohne dass die Substrate, um zu trocknen, spülen Sie sie in frischem Aceton, dann sofort in Isopropanol und trocken mit Stickstoff zu spülen.
- Fertigen Au Mikroelektroden auf der sauberen Substraten mit Standard-, Positiv-Ton Photolithographie oder Elektronenstrahl-Lithographie, abhängig von der Größe der gewünschten Funktionen. 3 Wenn der Gestaltung der Muster Geometrie, halten Sie die Durchmesser von jeder Elektrode Muster unter 100 Mikrometer, die Versorgung durch die gewährleistet PEG SAM (beschrieben im nächsten Abschnitt). Include Kontaktpads (~ 300 mm 2) positioniert 300 bis 500 mm aus dem Muster mit einem 1 mm Verbindungslinie der Pad mit der Elektrode (Abb. 1). Legen Sie die lithographische Muster in der Mitte des Substrats an Raum um das Muster für die Montage der Flusskammer ermöglichen.
Abbildung 1. Probengeometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. - Nach der Entwicklung des Musters in der Lackschicht, kratz eine Zeile in der von der Kontaktstelle an den Rand des Substrates mit einer Pinzette (Abb. 1) zu widerstehen. Nach Metallabscheidung wird die Grund erlauben den elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode und dem Rand des Substrates. Ein Abscheidekammer, vorzugsweise mit zwei Quellen, wird die Metallschicht zu hinterlegen. Die Elektroden sind durch Ablagerung von 2 nm von Cr (für die Adhäsion) von 6 nm Au gefolgt, ohne zu brechen Vakuum gebildet. Ein Quarzmikrowaage im Inneren der Kammer ausgestattet sind, können verwendet werden, um die Dicke der Folien während der Abscheidung zu messen.
Bereiten Sie die SAM
- Vorheizen und Backofen in einem gut belüfteten Raum auf 75 ° C Bereiten Sie die Silanisierung Lösung durch Zugabe von 20 ml Toluol in einen 250 mL Becherglas. Dann fügen Sie 1 mL PEG-Silan (dh 5% v / v), um das Toluol mit einem Kunststoff-Pipette. Mix in der PEG-Silan gut durch Auf-und Abpipettieren von 5 bis 10 mal und dann unter Rühren mit der Pipette für 30 Sekunden.
- Legen Sie die gemusterten Proben in das Becherglas mit der strukturierten Seite nach oben, um sicherzustellen, dass sie vollständig in der PEG-Silan-Toluol-Lösung getaucht und gleichmäßig über den Boden des Bechers angeordnet. Das Becherglas in den Ofen und backen 18 bis 21 Stunden bei 75 ° C. Während die SAM bildet, bereiten die Gegenelektrode (siehe unten) und montieren alle weiteren Komponenten für die verbleibenden Schritte erforderlich.
- Nach 18-21 Stunden im Ofen, sollte das Toluol verdampfen Verlassen des gemusterten Proben in einer viskosen PEG-Silan-Rückstand. Fügen Sie 20 ml Toluol in das Becherglas und genießen die Proben für 1-2 Minuten. Entfernen Sie die Proben aus dem Becher und gründlich mit Toluol, dann Isopropanol und schließlich mit Stickstoff trocken. An diesem Punkt sollten die Proben sauber aussehen und die SAM-Schicht sollte unsichtbar für das bloße Auge. SAMs vorbereitet auf diese Weise sind nutzbar für bis zu zwei Tagen, wenn sie unter kühlen und trockenen Bedingungen (25 ° C, mäßiger Luftfeuchtigkeit) gelagert. Erfolglose SAM-Bildung entsteht eine trübe oder unebenen hued Rückstände auf der Oberfläche.
Herstellung der Gegenelektrode
In der gleichen Abscheidekammer Setup für Mikroelektroden Abscheidung verwendet, um eine Gegenelektrode durch die Hinterlegung von 1 nm Cr, um 4 nm Au auf einer 22 x 50 mm Nr. 1 oder Nr. 0 Deckglas gefolgt. Die Gegenelektrode sollte fast transparent mit einem hellgrauen oder rosa Färbung. Bewahren Sie die Gegenelektrode beschichtet-side-up in einer Petrischale, um es sauber zu halten.
Polymerisieren Tubulin in MTs
- Thaw unmarkiertem Tubulin und Rhodamin Tubulin und sofort bei einem Verhältnis von 1:2 markiert, um unmarkierte zu hell MTs erhalten kombinieren. Mix von Auf-und Abpipettieren mehrmals. Polymerisieren die Tubulin für 20-40 Minuten in einem beheizten Wasserbad bei 37 ° C. Die Länge des MTs größer sein wird für längere Polymerisationszeiten. Während die Tubulin-Polymerisation ist, bereiten Sie einen PIPES-Taxol-Puffer durch Zugabe von Taxol zu 20 mM in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit PIPES-Puffer. Mix der Taxol auch durch Auf-und Abpipettieren mehrmals und Vortexen, und dann den Schlauch in das beheizte Bad bei 37 ° C. Nach der Polymerisation verdünnen MTs von 1 / 100 in warmen Rohren-Taxol-Puffer und Schildvon Licht. MTs auf diese Weise vorbereitet wird länglich im Laufe der Zeit und zu bündeln, die durch weitere Verdünnung reduziert werden kann.
- Bereiten Sie eine 10-Sauerstoffbindung Mischung (OS) durch die Kombination von 30 ml kaltem PIPES-Puffer (0-4 ° C), 5 ml 50% 2-Mercaptoethanol, 5 mL Glucose-Oxidase, 5 mL Katalase und 5 mL Glukose. 2 Die Glucose sollte letzte sein. Mix von Auf-und Abpipettieren 3-5 mal nach dem Hinzufügen jeder Komponente. Legen Sie die OS-Gemisch auf Eis, es bleibt für etwa 2 Stunden wirksam.
- Stellen Sie sicher, dass die MT Polymerisation erfolgreich war und dass die MTs sind unter mehreren Minuten Fluoreszenzanregung durch bildgebende die vorbereitete MTs mit 1x OS Mischung stabil. Für die Bildgebung der MTs auf diese Weise hergestellt werden, dass eine Anregung / Emission-Filter-Kombination eignet sich für Rhodaminfluoreszenz verwenden. Bestimmen Sie die besten Arbeitsbedingungen Verdünnung für die Bildgebung einzelnen Filamente durch weitere Verdünnung der MTs von 1 / 10 bis 1 / 100 mit Rohren Puffer und Bildgebung mit 1x OS mischen.
- Bereiten Sie eine Flusskammer durch Einfügen einer großen (22 x 50 mm) und kleine (22 x 22 mm) Deckglas mit zwei Stücken doppelseitigem Klebeband angebracht 2-3 mm auseinander. Das Band wird einfach in Streifen, indem sie auf einen Objektträger und Schneiden mit einer Rasierklinge geschnitten. Führen Sie ein paar Mikroliter MTs in die Messzelle mit einer Mikropipette. Für hohe Vergrößerung Bildgebung kann lange Objektive für die Abbildung der oberen Fläche der Flusskammer erforderlich sein. Der Abstand vom Deckglas / Probenoberfläche auf die Oberseite der Flusskammer wird durch die Dicke des Bandes bestimmt und sollte 60-100 mm sein.
Pattern MTs mittels Elektrophorese
- Bereiten Sie eine Elektrophoresekammer, indem man zwei dünne Streifen doppelseitiges Klebeband über die strukturierte, SAM-beschichteten Probe, so dass die Elektrode zwischen den Streifen mit dem Verbindungsweg senkrecht auf das Band (Abb. 2). Legen Sie die Gegenelektrode auf dem doppelseitigen Klebeband mit der metallenen Seite berühren Sie das Band, so dass die Kante der Probe Überhänge der Gegenelektrode um etwa 3 mm (Abb. 2). Cut mehrere 15 cm Länge der isolierten Kupfer-Lackdraht und Streifen 1 cm der Isolierung off der beiden Enden. Befestigen Sie einen Draht zu den exponierten Au Fläche des Substrats mit einem kleinen Tropfen Silber-Lackierung und gleichzeitig dafür Sorge zu vermeiden, einen elektrischen Kontakt mit der Gegenelektrode (dies kann mit einem Multimeter überprüft werden). Schließen Sie einen zweiten Draht zur Gegenelektrode mit Silberfarbe. Drähte mit Silberfarbe befestigt werden weiter zu den Proben mit Klebeband befestigt werden.
Abbildung 2. Durchfluss-Modul für eine invertierte Fluoreszenzmikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. - Einführung MTs in der gewünschten Verdünnung mit Pipes-Puffer mit OS auf 1x Endkonzentration kombiniert. Bild in 20-facher Vergrößerung und suchen Sie das Muster auf den Silizium-Wafer vor dem Anlegen einer Spannung. Optional kann der Strömungsraum abgedichtet mit Nagellack Strömungs-und MT Migration in der Ebene der Flusskammer zu verhindern.
- Tragen Sie eine Spannung von bis zu 1 V und beobachten die Migration von MTs. Niedrigere Spannungen (bis etwa 0,5 V) verwendet werden, wenn reversible Überfüllung von MTs erwünscht ist, aber dies erfordert Abdichtung der Flusskammer zur seitlichen Drift zu verhindern. Nagellack funktioniert gut für die Abdichtung der offenen Enden der Flusskammer. Bei Spannungen oberhalb von etwa 0.7 V, können einige MT Haftung auf das Muster gesehen werden, obwohl es wird schwach sein. Bei Spannungen oberhalb von etwa 0,9 V, wird das MT-Migrations schneller sein, und die Haftung stärker sein wird. Oberhalb von etwa 1,2 V die Wahrscheinlichkeit für die Induktion Elektrolyse (Gasblasenbildung) und auch für die Zerstörung der Mikroelektroden deutlich erhöht. Migration kann durch Einstellen der vertikalen Ebene der Fokus des Mikroskops verfolgt werden. Wenn richtig ausgeführt, wird die MTs an die Oberfläche der Elektroden lokalisiert werden.
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Discussion
Die Migration von MTS ist einfach visualisiert mittels Fluoreszenz-Mikroskopie aufgrund ihrer Helligkeit und der geringe Hintergrundfluoreszenz. Die Methode ist allgemein anwendbar auf Biomolekül Strukturierung, wie es verlangt nur, dass die Biomoleküle bewogen, eine Nettoladung durch eine geeignete Einstellung des pH tragen. Elektroosmose ist in dieser Konfiguration zu vermeiden, weil es keine geladenen Oberflächen wie z. B. die Kieselsäure Wände in der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden.
Mehrere Modifikationen dieser Methode sind möglich. Die Abdichtung der Enden der Flusskammer ist entscheidend, um die Reversibilität zu beobachten, weil die Verdunstung aus den offenen Enden Ursachen bulk Strömung und unerwünschte MT Migration. Oxidation des Silizium-Wafers vor der lithographischen Strukturierung wird die Leitung durch das Substrat zu verhindern, so dass für mehrere Elektroden mit unabhängigen Potentiale gleichzeitig verwendet werden.
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Acknowledgments
Wir erkennen an, Melissa Grunlan für hilfreiche Diskussionen über SAM-Bildung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Robert A. Welch Foundation (A-1585) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1 |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Acetone | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS grade |
| Catalase | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzene | EMD Millipore | MK441908 | ACS grade |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glucose | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Glucose oxidase | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanosine-5’-triphosphate | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Isopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS grade |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paclitaxel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | molecular weight 950K |
| Rhodamine tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T331M | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
| Toluene | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS grade |
| Tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T238 | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies. |
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References
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
