Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones

Summary

Se presenta un procedimiento para la formación de un poli (etilenglicol) auto-ensambladas monocapa (PEG-SAM) en un substrato de silicio con microelectrodos de oro. El PEG-SAM se forma en un solo paso y evita la contaminación biológica en las superficies de silicio y oro. Electroforesis se utiliza para modelar biomoléculas a la nanoescala.

Abstract

Se presenta un procedimiento para la formación de un poli (etilenglicol) (PEG) trimetoxisilano auto-ensambladas monocapa (SAM) en un substrato de silicio con microelectrodos de oro. El PEG-SAM se forma en una etapa de montaje simple y evita incrustaciones en las superficies de silicio y oro. El SAM se utiliza para microelectrodos abrigo estampado con el estándar, de tono positivo litografía. El uso de los microtúbulos como ejemplo, se aplica un voltaje de DC para inducir la migración electroforética al electrodo SAM recubiertos de una manera reversible. Una cámara de flujo se utiliza para obtener imágenes de la migración y los patrones de electroforesis de microtúbulos

Protocol

Preparación de los reactivos

Preparar tampón PIPES (80 TUBOS mM, 1 mM _MgCl2, 1 mM EGTA, ajustada a pH 6,8 con KOH). Alícuota y almacenar la glucosa oxidasa, catalasa y glucosa a -70 ° C y taxol a -20 ° C de acuerdo con los protocolos existentes. ^1,2 alícuotas y la tubulina almacenar a -70 ° C de acuerdo con las instrucciones que se incluyen por el proveedor.

Au microelectrodos patrón utilizando la litografía

1. Corte de obleas de silicio en sustratos 1 cm '1,5 cm con un escribano o un cortador de la oblea. Limpia los sustratos, colocándolos en un recipiente con acetona suficiente para cubrirlas y ultrasonidos durante 5 minutos. Sin permitir que el sustrato se seque, lávelos en acetona fresca, y luego enjuagar inmediatamente en nitrógeno con isopropanol y seco.
2. Fabricar microelectrodos Au sobre los sustratos limpios usando estándar, de tono positivo fotolitografía o litografía por haz de electrones, dependiendo del tamaño de las características deseadas. ³ En el diseño de la geometría del modelo, mantenga el diámetro de cada patrón de electrodos por debajo de 100 micrones para asegurar la cobertura de la PEG SAM (que se describe en la siguiente sección). Incluyen almohadillas de contacto (~ 300 mm ²⁾ posición 300 a 500 mm del modelo con una línea de 1 mm de conectar el teclado con el electrodo (Fig. 1). Coloque los patrones litográficos cerca de la mitad del sustrato para permitir que el espacio alrededor del patrón para el montaje de la cámara de flujo.
   
   Figura 1. Geometría de la muestra.
3. Después del desarrollo de la estructura de la capa de resistir, el principio de una línea en la resistencia de la plataforma de contacto con el borde del sustrato con una pinza (Fig. 1). Tras la deposición de metales, el cero se permite el contacto eléctrico entre el electrodo y el borde del sustrato. Una cámara de deposición, de preferencia con dos fuentes, se utiliza para depositar la capa de metal. Los electrodos están formados por la deposición de 2 nm de Cr (de adhesión), seguido de 6 nm de Au, sin romper el vacío. Una microbalanza de cristal de cuarzo equipado dentro de la cámara se puede utilizar para medir el espesor de las películas durante la deposición.

Preparar el SAM

1. Precaliente el horno y en un área bien ventilada a 75 ° C. Prepare la solución silanización añadiendo 20 ml de tolueno a un vaso de vidrio de 250 ml. A continuación, añadir 1 ml de PEG-silano (es decir, 5% v / v) para el tolueno con una pipeta de plástico. Mezcle en el PEG-silano y pipeteando arriba y abajo 5 a 10 veces y luego se agita con la pipeta durante 30 segundos.
2. Colocar las muestras patrón en el vaso con el lado estampado mirando hacia arriba, asegurándose de que estén completamente sumergidos en la solución de tolueno PEG-silano y se espacian uniformemente en la parte inferior del vaso. Coloque el recipiente en el horno y hornear 18 a 21 horas a 75 ° C. Mientras que el SAM se está formando, preparar el contraelectrodo (ver abajo) y ensamblar los componentes adicionales necesarios para el resto de pasos.
3. Después de 18-21 horas en el horno, el tolueno se evapora dejando las muestras patrón de un líquido viscoso PEG-silano residuos. Agregar 20 ml de tolueno en el vaso y tomar las muestras durante 1-2 minutos. Quitar las muestras del vaso y enjuagar con tolueno, a continuación, isopropanol, y finalmente en seco con nitrógeno. En este punto, las muestras deberán mirada limpia y la capa de SAM debe ser invisible a simple vista. SAM preparado de esta forma se pueden utilizar hasta dos días cuando se almacena bajo condiciones de frío seco (25 ° C, humedad moderada). Infructuosos resultados de la formación de SAM en una capa de residuos nublado o desiguales tonos en la superficie.

Fabricar el contraelectrodo

En la configuración de la cámara de deposición mismo que se utiliza para la deposición de microelectrodos, hacer un contraelectrodo depositando 1 nm de Cr, seguido de 4 nm de Au en un 22 x 50 mm N º 1 y N º 0 cubreobjetos. El contraelectrodo debe ser casi transparente con un tinte de color gris claro o rosa. Guarde el contraelectrodo recubierta de arriba abajo en una placa de Petri para mantenerlo limpio.

Tubulina polimeriza en MT

1. Descongele etiqueta tubulina y tubulina rodamina y de inmediato se combinan en una proporción de 1:2 etiquetados con etiqueta para obtener brillantes MTs. Mezclar pipeteando arriba y abajo varias veces. Polimeriza la tubulina durante 20-40 minutos en un baño de agua caliente a 37 ° C. La longitud de la MT serán mayores para los tiempos de polimerización más. Mientras que la tubulina se polimeriza, preparar un tampón PIPES-taxol mediante la adición de paclitaxel a 20 mm en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón PIPES. Mezclar el taxol y pipeteando arriba y abajo varias veces y agitación, y luego colocar el tubo en el baño se calienta a 37 ° C. Después de la polimerización, se diluye la MTs por 1 / 100 en caliente TUBOS taxol-buffer y el escudo de la luz. MTs preparado de esta manera se alarga más deel tiempo y el paquete, que puede ser reducida por dilución.
2. Preparar una mezcla de oxígeno 10 veces más basura (OS) mediante la combinación de 30 ml de tampón TUBOS frío (0-4 ° C), 5 ml de 50% 2-mercaptoetanol, 5 glucosa oxidasa ml, 5 ml de catalasa, glucosa y 5 ml. ² de la glucosa debe añadirse pasado. Mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo 3-5 veces después de agregar cada componente. Coloque la mezcla de OS en el hielo, sino que se mantendrá vigente por aproximadamente 2 horas.
3. Verifique que la polimerización MT fue un éxito y que la MT son estables en varios minutos de excitación de fluorescencia por imágenes de los preparados MTs con 1 mezcla de OS. Para obtener imágenes de los MTs preparado de esta manera, asegúrese de usar una combinación de excitación / emisión de filtro adecuado para la fluorescencia de rodamina. Determinar la dilución de trabajo óptima para los filamentos de imágenes individuales por diluyendo aún más el sistema multilateral de 1 / 10 a 1 / 100 con tampón PIPES y las imágenes con 1 mezcla de OS.
4. Preparar una cámara de flujo colocando un grande (22 x 50 mm) y pequeño (22 x 22 mm) cubreobjetos con dos pedazos de cinta de doble cara ponen 2-3 mm. La cinta es fácil de cortar en tiras, colocándolo en un portaobjetos de vidrio y el corte con una cuchilla de afeitar. Introducir unos pocos microlitros de MTs en la celda de flujo utilizando una micropipeta. Para imágenes de gran aumento, mucho trabajo los objetivos de la distancia puede ser necesario para obtener imágenes de la superficie superior de la cámara de flujo. La distancia desde la superficie del cubreobjetos / muestra a la superficie superior de la cámara de flujo se determina por el grosor de la cinta y debe ser 60 a 100 mm.

Patrón de MTs mediante electroforesis

1. Preparar una cámara de electroforesis mediante la colocación de dos finas tiras de cinta de doble cara en la muestra patrón, SAM recubiertos de tal manera que el electrodo se encuentra entre las tiras de conexión con la ruta perpendicular a la cinta (Fig. 2). Coloque el contraelectrodo en la cinta de doble cara con la parte de metal que tocan la cinta de tal manera que el borde de los aleros de la muestra el contraelectrodo en alrededor de 3 mm (Fig. 2). Corte varias longitudes de 15 cm de alambre de cobre con aislamiento magnético y tira de 1 cm del aislamiento de los dos extremos. Conecte un cable a la zona expuesta Au del sustrato con una pequeña gota de pintura de plata, mientras que teniendo cuidado de no hacer contacto eléctrico con el contraelectrodo (esto se puede comprobar con un multímetro). Conecte un segundo cable al contraelectrodo con pintura plateada. Cables conectados con la pintura de plata puede ser más seguro para las muestras con cinta adhesiva.
   
   Figura 2. Flujo conjunto de células de un microscopio de fluorescencia invertido.
2. Introducir MTs a la dilución deseada utilizando tampón PIPES combinado con el sistema operativo a 1x concentración final. Imagen de 20X y localizar el patrón en la oblea de silicio antes de aplicar un voltaje. Opcionalmente, la cámara de flujo pueden ser sellados con esmalte de uñas para evitar que el flujo de fluidos y la migración de MT en el plano de la cámara de flujo.
3. Aplique una tensión de hasta 1 V y observar la migración de las MTs. Voltajes más bajos (hasta cerca de 0.5 V) se puede utilizar si atrapando reversible de MTs se desea, sin embargo esto requiere de sellado de la cámara de flujo para evitar la deriva lateral. Esmalte de uñas que funciona bien para el sellado de los extremos abiertos de la cámara de flujo. Con tensiones superiores a unos 0,7 V, algunos de adhesión MT puede ser visto en el patrón, aunque será débil. Tensiones superiores a alrededor de 0,9 V, la migración de MT será más rápido, y la adhesión será más fuerte. Por encima de alrededor de 1,2 V de la probabilidad de inducción de la electrólisis (formación de burbujas de gas) y también para la destrucción de los microelectrodos se incrementa significativamente. La migración puede ser rastreado mediante el ajuste del plano vertical del foco del microscopio. Si se lleva a cabo correctamente, el MTS se localizan en la superficie de los electrodos.

Discussion

La migración de MT es fácil de visualizar mediante microscopía de fluorescencia debido a su brillo y la fluorescencia de fondo bajo. El método es aplicable en general a los patrones de biomoléculas, ya que sólo se requiere que las biomoléculas ser inducidos a realizar un cargo neto por el ajuste adecuado del pH. Electroósmosis se evita en esta configuración, porque no hay superficies cargadas, tales como las paredes de sílice utilizado en electroforesis capilar.

Varias modificaciones de este método es posible. Sellado de los extremos de la cámara de flujo es fundamental para observar la reversibilidad, porque la evaporación de los extremos abiertos hace que el flujo de líquido a granel y la migración MT indeseables. La oxidación de la oblea de silicio antes de modelar litográfica evitará que la conducción a través del sustrato, lo que permite múltiples electrodos con potenciales independiente para ser utilizados simultáneamente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.