Summary
We presenteren een procedure voor het vormen van een poly (ethyleenglycol) zelf-geassembleerde monolaag (PEG-SAM) op een silicium substraat met gouden micro-elektroden. De PEG-SAM is gevormd in een enkele stap en voorkomt biofouling op silicium en goud oppervlakken. Elektroforese wordt dan gebruikt voor patronen biomoleculen naar de nanoschaal.
Abstract
We presenteren een procedure voor het vormen van een poly (ethyleenglycol) (PEG) trimethoxysilaan zelf-geassembleerde monolaag (SAM) op een silicium substraat met gouden micro-elektroden. De PEG-SAM is gevormd in een assemblage stap en voorkomt biofouling op silicium en goud oppervlakken. De SAM is gebruikt voor het bekleden micro-elektroden patroon met standaard, positieve-tone lithografie. Met behulp van de microtubule als een voorbeeld, passen we een DC-spanning op elektroforetische migratie ertoe te brengen de SAM-gecoate elektrode in een omkeerbare manier. Een stroom kamer wordt gebruikt voor beeldvorming van de elektroforetische migratie en microtubuli patronen
Protocol
Bereiding van reagentia
Bereid LEIDINGEN buffer (80 mm buizen, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, ingesteld op een pH 6,8 met KOH). Aliquot en op te slaan glucose-oxidase, catalase en glucose bij -70 ° C en taxol bij -20 ° C volgens bestaande protocollen. 1,2 Aliquot en bewaar tubuline bij -70 ° C volgens de instructies die door de leverancier.
Patroon met behulp van micro-elektroden Au lithografie
- Snijd silicium wafers in 1 cm "1,5 cm substraten met behulp van een schrijver of een wafer cutter. Het reinigen van de substraten door ze in een bekerglas met genoeg aceton om ze te bedekken en gedurende 5 minuten ultrasone trillingen. Zonder dat de substraten te drogen, spoel ze in verse aceton, vervolgens onmiddellijk in isopropanol en droog met behulp van stikstof.
- Fabriceren Au micro-elektroden op de schone ondergrond met behulp van standaard, positieve toon fotolithografie of electron beam lithografie, afhankelijk van de grootte van de gewenste functies. 3 Bij het ontwerpen van het patroon geometrie, de diameter van elke elektrode patroon onder de 100 micron te houden om de dekking te verzekeren door de PEG SAM (beschreven in de volgende paragraaf). Onder andere contact met pads (~ 300 mm 2) geplaatst 300 tot 500 mm van de patroon met een 1 mm lijn die het pad met de elektrode (fig. 1). Plaats de lithografische patronen in het midden van de ondergrond om ruimte vrij rond het patroon voor de montage van de stroming kamer.
Figuur 1. Sample geometrie. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien. - Na de ontwikkeling van het patroon in het weerstaan laag, kras een lijn in het weerstaan van het contact pad aan de rand van de ondergrond met een pincet (afb. 1). Bij metalen afzetting, zal de kras laat elektrisch contact tussen de elektrode en de rand van het substraat. Een afzettingskamer, bij voorkeur met twee bronnen, wordt gebruikt om de metaallaag storting. De elektroden worden gevormd door afzetting van 2 nm van Cr (voor adhesie) gevolgd door 6 nm van Au, zonder te breken vacuüm. Een kwartskristal microbalans uitgerust in de kamer kan worden gebruikt om de dikte van de films te meten tijdens de depositie.
Bereid de SAM
- Verwarm de oven en in een goed geventileerde ruimte tot 75 ° C. Bereid de silanisatie oplossing door het toevoegen van 20 ml tolueen in een 250 mL bekerglas. Voeg vervolgens 1 ml PEG-silaan (dwz 5% v / v) om het tolueen met behulp van een plastic pipet. Meng de PEG-silaan goed door en neer te pipetteren 5 tot 10 keer en dan roeren met de pipet gedurende 30 seconden.
- Plaats de patroon monsters in het bekerglas met het patroon zijde naar boven en zorg ervoor dat ze volledig worden ondergedompeld in de PEG-silaan tolueen oplossing en zijn gelijkmatig over de bodem van de beker. Plaats het bekerglas in de oven en bak 18 tot 21 uur bij 75 ° C. Terwijl de SAM is de vorming, de voorbereiding van de tegenelektrode (zie hieronder) en monteren alle extra componenten nodig zijn voor de resterende stappen.
- Na 18 tot 21 uur in de oven, moet de tolueen verdampt het verlaten van het patroon monsters in een viskeuze PEG-silaan residu. Voeg 20 ml tolueen in het bekerglas en laat de monsters voor 1-2 minuten. Verwijder de monsters uit de beker en spoel met tolueen, dan isopropanol, en tot slot droog met stikstof. Op dit punt, moeten de monsters er schoon en de SAM laag moet onzichtbaar zijn voor het blote oog. SAM voorbereid op deze manier bruikbaar zijn voor maximaal twee dagen bij opslag onder de koele en droge omstandigheden (25 ° C, matige vochtigheid). Mislukte SAM vorming resulteert in een troebel of ongelijke hued residu coating op het oppervlak.
Fabriceren van de tegenelektrode
In dezelfde afzettingskamer setup gebruikt voor micro-elektrode depositie, maak een tegenelektrode door het storten van 1 nm van Cr, gevolgd door 4 nm van Au op een 22 x 50 mm nummer 1 of nummer 0 glazen dekglaasje aan. De tegenelektrode moet bijna transparante met een licht grijs of roze tint. Bewaar de tegenelektrode gecoate-side-up in een petrischaal schoon te houden.
Polymeriseren tubuline in de MT's
- Dooi ongelabelde tubuline en rhodamine tubuline en onmiddellijk te combineren in een verhouding van 1:2 gelabeld om gelabelde tot helder MT te verkrijgen. Meng door en neer te pipetteren meerdere malen. Polymeriseren de tubuline voor 20-40 minuten in een verwarmd waterbad bij 37 ° C. De lengte van de MT's zal groter zijn voor een langere polymerisatie tijden. Terwijl de tubuline polymerisatie is, bereiden een pijpen-taxol buffer door het toevoegen van taxol tot 20 mm in een microcentrifugebuis met BUIZEN buffer. Meng het door taxol en neer te pipetteren meerdere malen en vortexen, en vervolgens de buis in het verwarmde bad bij 37 ° C. plaats Na de polymerisatie, verdun het MT van 1 / 100 in warm pijpen-taxol buffer en schildtegen licht. MT voorbereid op deze manier zullen verlengen in de tijd en bundel, die kan worden verminderd door verdere verdunning.
- Bereid een 10x zuurstof scavenging mengsel (OS) door het combineren van 30 ml koud BUIZEN buffer (0-4 ° C), 5 ml 50% 2-mercapto-ethanol, 5 ml glucose-oxidase, catalase 5 ml en 5 ml glucose. 2 De glucose moet worden toegevoegd afgelopen. Meng door en neer te pipetteren 3-5 maal na het toevoegen van elke component. Plaats de OS mengsel op ijs, het zal van kracht blijven gedurende ongeveer 2 uur.
- Controleer of de MT polymerisatie succesvol was en dat de MT's zijn stabiel onder een paar minuten van de fluorescentie excitatie door beeldvorming van het MT bereid met 1x OS mix. Voor beeldvorming van de MT's voorbereid op deze manier, moet u een excitatie / emissie filter combinatie die geschikt zijn voor rhodamine fluorescentie gebruik. Bepaal de beste werkverdunning voor het afbeelden van individuele filamenten door verdere verdunning van de MT's met 1 / 10 tot 1 / 100 met behulp van BUIZEN buffer en beeldvorming met 1x OS mix.
- Bereid een stromingskamer door daartussen een groot (22 x 50 mm) en kleine (22 x 22 mm) glazen dekglaasje met twee stukken van dubbelzijdige tape geplaatste 2-3 mm uit elkaar. De tape is gemakkelijk in reepjes gesneden door het op een glasplaatje en snijden met een scheermesje. Introduceer een paar microliter van MTS in de stroom cel met behulp van een micropipet. Voor hoge vergroting beeldvorming, kan lange werkafstand doelstellingen nodig zijn voor de beeldvorming van de bovenkant van de stroming kamer. De afstand van het dekglaasje / monster oppervlak naar de bovenkant van de stroom kamer wordt bepaald door de dikte van de tape en moet 60-100 mm zijn.
Patroon MT's met behulp van elektroforese
- Bereid een elektroforese kamer door het plaatsen van twee dunne stroken dubbelzijdige tape over het patroon, SAM-gecoate monster zodanig dat de elektrode is tussen de strips met de verbindende pad loopt loodrecht op de band (Fig. 2). Plaats de tegenelektrode op de dubbelzijdige tape met de metalen kant het aanraken van de tape zodanig dat de rand van het monster overhang van de tegenelektrode met ongeveer 3 mm (afb. 2). Snij een aantal 15 cm lengte van de geïsoleerde koperen draad en magneet strip 1 cm van de isolatie af van beide uiteinden. Breng een draad aan de blootgestelde Au gebied van de ondergrond met behulp van een kleine druppel zilveren verf, terwijl de zorg om te voorkomen dat elektrisch contact met de tegenelektrode (dit kan worden gecontroleerd met een multimeter). Bevestig een tweede draad aan de tegenelektrode met zilveren verf. Draden verbonden met zilveren verf kan verder worden bevestigd aan de monsters met tape.
Figuur 2. Flow cel assemblage voor een omgekeerde fluorescentie microscoop. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien. - Introduceer MT op de gewenste verdunning gebruik van pipes buffer in combinatie met OS bij 1x uiteindelijke concentratie. Beeld bij 20x vergroting en zoek het patroon op de silicium wafer voor het aanbrengen van een spanning. Optioneel kan de stroom kamer worden afgedicht met behulp van nagellak om de vloeistof stromen en MT migratie in het vlak van de stroming kamer te voorkomen.
- Breng een spanning tot 1 V en observeren migratie van MT. Lagere spanningen (tot ongeveer 0,5 V) kan worden gebruikt als omkeerbaar vangen van MT's is gewenst, maar dit vereist het afdichten van de stroom kamer van zijdelingse drift te voorkomen. Nagellak werkt goed voor het afdichten van de open einden van de stroming kamer. Bij spanningen boven ongeveer 0,7 V, kunnen sommige MT hechting te zien aan het patroon, maar het zal zwak zijn. Bij spanningen boven ongeveer 0,9 V, zal de MT migratie sneller, en de hechting zal sterker zijn. Boven ongeveer 1,2 V de kans voor het induceren van elektrolyse (gasbel vorming) en ook voor het vernietigen van de micro-elektroden aanzienlijk verhoogt. Migratie kan worden gevolgd door het aanpassen van het verticale vlak van focus van de microscoop. Indien correct worden uitgevoerd, zal het MT lokaliseren op de elektrode oppervlakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De migratie van MT's is eenvoudig gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie door hun helderheid en de lage achtergrond fluorescentie. De methode is algemeen van toepassing op biomolecuul patronen, omdat het alleen vereist dat de biomoleculen worden geïnduceerd met een netto lading te dragen door een geschikte aanpassing van de buffer pH. Elektro is vermeden in deze opstelling, omdat er geen geladen oppervlakken, zoals de silica muren gebruikt in de capillaire elektroforese.
Verschillende wijzigingen van deze methode zijn mogelijk. Het afdichten van de uiteinden van de stroming kamer is van cruciaal belang omkeerbaarheid observeren, omdat verdamping uit de open einden oorzaken bulk vloeistofstroom en ongewenste MT migratie. Oxidatie van de silicium wafer voorafgaand aan de lithografische patronen wordt voorkomen dat de geleiding door het substraat, waardoor voor meerdere elektroden met onafhankelijke potentialen gelijktijdig gebruikt worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij erkennen Melissa Grunlan voor nuttige discussies over SAM vorming. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Robert A. Welch Foundation (A-1585).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1 |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Acetone | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS grade |
| Catalase | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzene | EMD Millipore | MK441908 | ACS grade |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glucose | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Glucose oxidase | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanosine-5’-triphosphate | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Isopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS grade |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paclitaxel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | molecular weight 950K |
| Rhodamine tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T331M | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
| Toluene | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS grade |
| Tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T238 | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies. |
|||
References
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
