حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Summary

طورنا رواية متعددة المقصورة منصة عصبون الميكروسيستم المشترك لثقافة البحوث في المختبر CNS التفاعل محوار - الدبقية. منصة قادرة على اجراء تجارب تصل إلى ستة المستقلة بالتوازي وكانت ملفقة باستخدام المطورة حديثا الكلي / الجزئي أسلوب تلفيق الهجين.

Abstract

نقدم رواية متعددة المقصورة منصة عصبون الميكروسيستم المشترك للثقافة في الجهاز العصبي المركزي البحوث المختبرية التفاعل محوار - الدبقية ، وقادرة على إجراء ما يصل إلى ست تجارب مستقلة في موازية لسرعة أعلى ،. طورنا طريقة تصنيع جديدة لخلق وجود هياكل الأجهزة ميكروفلويديك النطاق الجزئي والكلي على حد سواء داخل الجهاز نفسه من خلال عملية الطباعة الحجرية الناعمة واحد ، مما يمكن تلفيق الشامل مع التكرار جيدة.

وتتكون المقصورة متعددة ميكروفلويديك شارك في الثقافة منصة واحدة لمقصورة سوما الخلايا العصبية وستة مقصورات محوار / الدبقية لoligodendrocytes (شريان الحياة). ترتبط مقصورة سوما ومحوار / الدبقية المقصورات بها سلسلة من محور عصبي في توجيه microchannels التي تؤدي وظيفة الحواجز المادية لحصر العصبية سوما سوما في المقصورة ، في حين يسمح لتنمو لتصبح المحاوير محوار / الدبقية المقصورات. ويمكن تحميلها في عملية شريان الحياة محوار / الدبقية مقصورات تتفاعل فقط مع محاور عصبية ولكن ليس مع سوما أو التشعبات العصبية ، وتمكين التفاعل الدراسات المترجمة محوار - الدبقية. كما مكنت هذه microchannels fluidic العزلة بين المقصورات ، مما يسمح أجريت ست تجارب مستقلة على جهاز واحد لأعلى إنتاجية.

لينة الطباعة الحجرية باستخدام بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) هي تقنية تستخدم عادة في الأجهزة بالغة الصغر الطبية الحيوية. وتعرف عادة الخزانات على هذه الأجهزة التي اللكم اليدوي. على الرغم من البساطة ، والمحاذاة الفقراء وقتا طويلا من طبيعة العملية يجعل من هذه العملية لا تصلح عند عدد كبير من الخزانات يجب أن تكون خلقت مرارا وتكرارا. لم الأسلوب وضعت حديثا لا تتطلب اللكم دليل الخزانات ، والتغلب على هذه القيود. الأولى ، وسبعة خزانات (العمق : 3.5 ملم) وأدلى على كتلة بولي (PMMA) (ميثاكريلات الميثيل) باستخدام آلة طحن الصغرى. ثم ، كانت صفائف المجهرية التلال ، وملفقة على ركيزة الزجاج ، وتنقش على الساخن ضد كتلة PMMA لتحديد microchannels التي تربط محور عصبي وسوما / الدبقية المقصورات. أدت هذه العملية في الماكرو النطاق الخزانات (3.5 ملم) والصغيرة الحجم قنوات (2.5 ميكرومتر) ليتزامن داخل الماجستير PMMA واحد. تم الحصول على نسخة PDMS الذي كان بمثابة القالب الرئيسي باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة وكان جهاز نسخ PDMS النهائي من هذا الماجستير.

تم تحميلها من الخلايا العصبية الأولية E16 - 18 الفئران إلى مقصورة سوما والمثقفين لمدة أسبوعين. بعد أسبوع واحد من خلية ثقافة ، عبر محاور microchannels ، وشكلت طبقة الشبكة محواري فقط داخل المحوار / الدبقية المقصورات. أضيفت المحاوير نمت بشكل موحد في جميع أنحاء مقصورات محوار / الدبقية ستة وعملية شريان الحياة من P1 - 2 الفئران لمحوار / الدبقية مقصورات في 14 يوما في المختبر للثقافة المشترك.

Protocol

الجزء 1 : إعداد قالب الرئيسي لمقصورة متعددة الخلايا العصبية تصنيع الجهاز المشترك الثقافة

1. الخطوة الأولى لافتعال PMMA الرئيسي هو جعل 3،5 مم مقصورات العميق. يتم تعريف واحد وستة مقصورة سوما مقصورات محوار / الدبقية على كتلة PMMA باستخدام آلة طحن الصغرى (MDX - 40 ، رولان أو أي آلة طحن CNC الأخرى). ومن ثم sonicated PMMA الماجستير في ايزوبروبيل لمدة 10 دقائق لازالة الحطام.
2. هي منقوشة صفائف من 2.5 ميكرومتر هياكل التلال العالية على 50.8 مم X 50.8 ملم الزجاج الشريحة من خلال عملية ضوئيه القياسية ، تليها النقش الرطب من الزجاج.
   الأولى ، هي مجموعة من هياكل منقوشة التلال على ركيزة الزجاج تنظيفها مع S1818 مقاوم الضوء الإيجابي باستخدام ضوئيه. S1818 هي تدور المغلفة على الركيزة (4000 دورة في الدقيقة) ، التي يوجد مقرها في لينة 110 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية (84 مللي جول / سم ²⁾ باستخدام قناع اليجنر تليها النامية من مقاوم الضوء في MF319 لمدة 40 ثواني. المقبل ، والزجاج المزخرف مغمورة مقاوم الضوء الركيزة أكسيد مخزنة في حفر (BOE) في درجة حرارة الغرفة ل6-7 دقيقة للحصول على 2.5 ميكرومتر هياكل التلال العالية. أخيرا ، يتم إزالة طبقة مقاومة للضوء عن طريق الأسيتون والكحول الآيزوبروبيل ، تليها شامل الشطف في الماء (DI) غير المتأينة.
3. الركيزة الزجاج مع التلال الصغيرة والهياكل الساخنة تنقش ضد PMMA الرئيسي لنقل أنماطه.
   أولا ، يتم محاذاة يدويا PMMA الماجستير العفن وركائز الزجاج ووضعها على الصحافة الساخنة. ثم يتم رفع درجة الحرارة إلى 115 درجة مئوية. حالما يتم التوصل إلى درجة الحرارة المطلوبة ، يتم تطبيق 0،5 طن من الوزن لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، ويتم تبريد درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية ويتم تحرير الضغط. ثم يتم قطع سيد PMMA إلى 50.8 مم X 50.8 ملم حجم الكتلة.
4. يتم خلط PDMS قبل البوليمر (Sylgard 184) مع وكيل علاج في نسبة 10 : 1 من وزنه.
5. يوضع PMMA الرئيسي داخل برميل خشبي ويسكب الخليط PDMS على رأس سيد PMMA الى افتعال الرئيسي PDMS. يوضع بعد ذلك في مجفف متصلة مضخة فراغ. سكب PDMS على رأس سيده PMMA هو degassed ثم لمدة 15 دقيقة لإزالة الفقاعات تولد خلال عملية خلط PDMS.
6. عندما تتم إزالة كافة الفقاعات ، يتم وضع PDMS داخل الفرن وتعادل 85 درجة مئوية لمدة ساعة للبلمرة.
7. حالما يتم الشفاء تماما PDMS ، هو مقشر PDMS الرئيسي الخروج من الماجستير PMMA ووضعها داخل مجفف 2-3 مع قطرات من trichlorosilane والمكنسة الكهربائية لمدة 15 دقيقة لمعطف بخار السطح الرئيسي PDMS. طلاء Trichlorosilane يسهل الافراج عن المباراة النهائية الأجهزة PDMS شارك في ثقافة من الخلايا العصبية الرئيسية PDMS. بعد طلاء ، وتشطف سيد PDMS مع ايزوبروبيل لإزالة trichlorosilane المفرطة ، والمجففة مع غاز ₂ N.

الجزء 2 : العصبية تكرار الجهاز الثقافة

1. يتم خلط PDMS قبل البوليمر (Sylgard 184) مع وكيل علاج في نسبة 10 : 1 من وزنه.
2. يسكب الخليط PDMS على رأس سيد PDMS وdegassed داخل مجفف متصلة مضخة فراغ لمدة 15 دقيقة. فمن المهم عدم صب PDMS كثيرا بحيث لا يتم 3.5 ملم هيكل PDMS عالية على الشريحة الرئيسية مغمورة تماما.
3. عندما تتم إزالة كافة الفقاعات ، يتم وضع PDMS داخل الفرن وتعادل 85 درجة مئوية لمدة ساعة للبلمرة.
4. يؤخذ PDMS خارج من الفرن بعد ساعة واحدة وترك في درجة حرارة الغرفة حتى يبرد. ثم ، يتم تقشيرها بلطف الأجهزة PDMS ثقافة الخروج من الخلايا العصبية الرئيسية PDMS. خلع الأجهزة PDMS هي ملفوفة مع parafilm لحمايتهم من الغبار أو الحطام.
5. يتم قطع PDMS الأجهزة ، مغلفة parafilm ، إلى قطع فردية باستخدام الحفر الصحافة مزودة بشفرة.

الجزء 3 : تجميع الأجهزة

1. يوضع الجهاز PDMS ثقافة العصبية داخل نظافة البلازما البلازما ومعرضة للهواء لمدة 90 ثانية لجعل سطح الجهاز PDMS ماء. وهذا العلاج البلازما تسهيل microchannels الواجب ملؤها مع وسائل الاعلام بعد التجميع للثقافة بولي د يسين الركيزة المغلفة.
2. مغمورة ثم تعامل مع أجهزة البلازما في الايثانول 70 ٪ لمدة 30 دقائق للتعقيم وتوغلت داخل غطاء المحرك الحيوي للتعقيم.
3. تتخذ أجهزة تعقيم الخروج من الإيثانول بنسبة 70 ٪ والمجففة مع تصفية الغاز ميليبور ₂ N. وضعت أجهزة المجففة على رأس بولي د يسين البوليسترين المغلفة يطبق 6 - جيدا لوحة والثقافة ، وضغط لطيف لضمان ختم بين الركيزة والجهاز.
4. ثم يتم تعبئة ثقافة الإعلام في حجرة سوما ، تليها ملء ستة محوار / الدبقية المقصورات. فمن الأفضل أن تعطي وقفة 1-2 دقائق قبل ملء محوار / الدبقية مقصورات بعد إضافة وسائل الإعلام إلى الثقافة مقصورة سوما لضمان محاصرين داخل فقاعات لا microchannels.
5. وحضنت أجهزة الإعلام مليئة ثقافة داخل الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل لشطف أي حطام من الممكن أو مخلفات سامة.

الجزء 4: تحميل الخلية العصبية وoligodendrocyte المشترك ، ثقافة

1. في اليوم الأول للثقافة الخلية الأولية والخلايا العصبية الجنينية الدماغ المقدم من يوم يتم تحميلها 16-18 الفئران في حجرة سوما في كثافة المساحي من 500 خلية / مم ^2. الأولى ، هي أن يستنشق وسائل الاعلام سواء داخل مقصورة الثقافة سوما ومحوار / الدبقية مقصورات باستخدام ماصة قبل التحميل الخلية. ثم ، يتم تحميل خلايا 38500 ، مخففة في 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام والثقافة ، وإلى المقصورة سوما حول مداخل متناهية. فمن المهم عدم لمس الجهاز أثناء تحميل PDMS الخلايا ، لأنه يستطيع ان يكسر الختم بين الجهاز والركيزة ل.
2. احتضان الأجهزة الخلوية تحميل لمدة 30 دقيقة داخل حاضنة 37 درجة مئوية لتعزيز التصاق الخلية إلى الركيزة. بعد مرور فترة الحضانة ، يتم شغل جميع المقصورات مع وسائل الإعلام الثقافة.
3. يتم استزراع خلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5 ٪ CO ₂ حاضنة ويتم تغيير نصف فقط من وسائل الإعلام من ثقافة كل 3-4 أيام.
4. بعد 14 يوما من ثقافة العصبية في المختبر ، تضاف إلى oligodendrocytes المقصورات محوار / الدبقية للثقافة المشترك. تضاف Oligodendrocytes ، تشريح من نصفي الكرة المخية من سبراغ داولي الفئران في يوم ما بعد الولادة 1-2 ، في كل مقصورة محوار / الدبقية في كثافة مساحة 1000 خلية / مم ^2. قبل خلايا التحميل ، ويستنشق حوالي 60 ٪ من وسائل الإعلام الثقافة داخل المقصورات مع ماصة. يجب أن يتم بحذر على عدم لمس الركيزة أسفل ، لأنه يمكن ان يسبب تلفا في شبكة محواري تشكلت على الركيزة. ثم ، تضاف الخلايا oligodendrocyte 6700 ، مخففة في 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام والثقافة ، ومقصورات للمحوار / الدبق. يتم تحضين الخلايا لمدة 1 ساعة وتمتلئ وسائل الإعلام مقصورات مع الثقافة.
5. يتم استزراع خلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5 ٪ CO ₂ حاضنة فقط ويتم تغيير نصف ثقافة وسائل الإعلام من كل 3-4 أيام لمدة أسبوعين آخرين.

الجزء 5 : نتائج الممثل :

عندما يتم إجراء التجارب على نحو سليم ، والخلايا العصبية لتحميل مقصورة سوما موقع على مقربة من مداخل متناهية وطبقة محواري بداية لتشكيل محور عصبي داخل المقصورات / 1 الدبقية بعد اسبوع من الثقافة. ويمكن توقع التجميع الخلية العصبية داخل المقصورة سوما يكون دليلا على أن الخلايا ليست صحية. يجب أن يتم تحميل عند تحميل oligodendrocytes بعد اسبوعين من ثقافة العصبية ، يجب أن تكون مشمولة محوار / الدبقية مقصورات مع طبقة كثيفة من المحاور وoligodendrocytes في أعلى طبقة محواري.

الشكل 1. رسوم تخطيطية للمنصة عالية الإنتاجية CNS ميكروفلويديك متعددة المقصورة التعاون ثقافة الخلايا العصبية. مستعرضة رأي تظهر عزلة محاور عصبية من الخلايا العصبية ، والتشعبات سوما فضلا عن العزلة fluidic بين المقصورات مع فارق المستوى fluidic دقيقة. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2. التصنيع والتجميع لخطوات متعددة المقصورة PDMS ميكروفلويديك شارك في الثقافة الجهاز. كل جهاز في واحد يناسب جيدا تقليدية لوحة البوليسترين 6 - جيدا ثقافة الخلية. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

Discussion

وقد طورنا حجرة متعددة شاركت في الثقافة منصة لدراسة الثدييات CNS محوار - الدبقية التفاعل. وقد تم عزل بنجاح CNS المحاوير من الخلية العصبية الهيئات / التشعبات ، وكانت بنجاح oligodendrocytes المشترك تربيتها داخل الجهاز. يمكن أن تختلف كثافة الخلايا العصبية من قبل التطبيقات ، ولكن تركيز منخفض جدا أو مرتفعة جدا يمكن أن يسبب الخلايا ليموت. أيضا ، من المهم أن تغير من وسائل الإعلام سوى نصف الثقافة بحيث لا تلف الخلايا أو طبقة محواري على الركيزة. نحن نتوقع أن هذا النظام سوف يكون أداة قوية لدراسة الجهاز العصبي المركزي ، محوار الدبقية الإشارات الشبكات في المختبر ، وتوفير مسار نحو منصة عالية الإنتاجية لعوامل النمو الفرز أو المرشحين المحتملين المخدرات التي تروج تكون الميالين وإصلاح النخاعين.