Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Summary

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Abstract

Biz paralel olarak daha çok verim sağlayan altı bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahip bir roman, in vitro MSS akson-glia etkileşim araştırmaları için çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platform sunuyoruz. Biz iyi tekrarlanabilirlik ile kitle imalat sağlayan tek bir yumuşak litografi süreci boyunca aynı cihaz içinde hem mikro ve makro ölçekli yapılara sahip mikroakışkan cihazlar oluşturmak için yeni bir imalat yöntemi geliştirdi.

Çok bölmesi mikroakışkan ko-kültür platformu için bir oligodendrosit nöron (EKK) ve altı akson / glia bölmeleri soma bölmesinin oluşmaktadır. Soma bölmesi ve akson / glia bölmeleri dizileri bağlı akson rehberlik mikro aksonlar akson / glia bölmeleri içine büyümeye izin verirken, fiziksel engelleri, nöronal soma soma bölmesi sınırlandırmak için fonksiyonu. Akson / glia bölmeye yüklü OLS lokalize akson glia etkileşim çalışmaları sağlayan aksonlar ile değil nöronal soma veya dendritler ile etkileşimde bulunabilirsiniz. Mikro da altı bağımsız deneyler daha yüksek verim için tek bir cihaz üzerinde yapılacak sağlayan, bölmeleri arasında akışkan izolasyon sağladı.

Soft-litografi poli (dimethylsiloxane) (PDMS) kullanarak biyomedikal microdevices yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu cihazlarda Rezervuarlar yaygın manuel delme tarafından tanımlanır. Basit, yoksul uyum ve zaman alıcı bir süreç doğası rezervuarların çok sayıda oluşturulan sürekli olması bu sürecin ne zaman uygun hale getirir. Yeni geliştirilen yöntem, bu tür sınırlamaları tamamen ortadan kaldırıp, rezervuarların manuel delme gerek kalmadı. İlk olarak, yedi rezervuarlar (derinlik: 3.5 mm) bir mikro-freze makinesi kullanarak bir poli (metil metakrilat) (PMMA) blok yapıldı. Sonra bir cam substrat fabrikasyon sırt mikro dizileri, soma ve akson / glia bölmeleri bağlayan mikro tanımlamak için PMMA blok karşı sıcak kabartmalı. Bu süreç tek bir PMMA ana içinde denk makro ölçekte su deposu (3,5 mm) ve mikro-ölçekli kanal (2.5 mikron) sonuçlandı. Bir kalıp ustası olarak görev yapmış bir PDMS çoğaltma yumuşak litografi ve son PDMS cihaz bu ana çoğaltılır kullanılarak elde edilmiştir.

E16-18 sıçan İlköğretim nöronların soma bölmesi yüklenir ve iki hafta boyunca kültüre edildi. Hücre kültürü bir hafta sonra, aksonlar mikro geçti ve akson / glia bölmeleri içinde aksonal yalnızca ağ tabakası oluşturdu. Aksonlar P1-2 sıçanlarda altı akson / glia bölmeleri ve OLS boyunca eşit büyüdü in vitro ko-kültür için 14 gün akson / glia bölmeleri eklenmiştir.

Protocol

Bölüm 1: çok bölmesi için bir ana kalıp hazırlama nöron ko-kültür cihaz imalatı

1. PMMA ana imal etmek için ilk adım 3,5 mm derin bölmeleri yapmaktır. Bir soma bölmesi ve altı akson / glia bölmeleri, bir mikro-freze makinesi (MDX-40, Roland veya başka herhangi bir CNC freze) kullanarak PMMA blok tanımlanır. PMMA ana enkaz kaldırmak için 10 dakika sonra izopropil alkol sonicated.
2. 2.5 mikron yüksek sırt yapıların Diziler cam ıslak aşındırma, standart bir fotolitografi işlem tarafından 50,8 mm x 50,8 mm cam slayt, desenli.
   Birincisi, sırt yapıların dizi fotolitografi kullanarak olumlu fotorezist S1818 ile temizlenmiş cam substrat desenli. S1818 110 yumuşak substrat (4000 rpm), spin kaplı ° 5 dakika sonra C ve 40 MF319 fotorezist gelişmekte olan bir maske hizalama kullanarak UV ışık (84 mJ / cm ²⁾ maruz saniye. Sonra, paslanmaz çeliğin desenli cam substrat 2.5 mikron boyunda sırt yapılar elde etmek için 6-7 dakika oda sıcaklığında etch tamponlu oksit (BOE) batırılır. Son olarak, paslanmaz çeliğin katman kapsamlı de-iyonize (DI) su ile durulama ardından, aseton ve izopropil alkol ile kaldırılır.
3. Mikro-sırt yapıları Cam substrat kalıplarını aktarmak için PMMA master karşı sıcak kabartmalı.
   İlk olarak, PMMA kalıp master ve cam tabanlar elle hizalanmış ve sıcak bir basın yerleştirilir. Daha sonra, sıcaklık 115 yükseltilir ° C Bir kez istenen sıcaklığa ağırlığı 0.5 ton 5 dakika süreyle uygulanır ulaştı. 5 dakika sonra, sıcaklık 40 ° C ve basınç soğutulur. PMMA ana 50.8 mm x 50.8 mm boyutlarında bloğu bölünür.
4. 1 kilo: PDMS pre-polimer (Sylgard 184) 10 oranında sertleştirici ile karıştırılır.
5. PMMA ana, bir varil ve PDMS karışımı bir PDMS ana imal PMMA ustanın üstüne dökülür içine yerleştirilir. Daha sonra bir vakum pompasına bağlı bir desikatöre yerleştirilir. PDMS sonra PDMS karıştırma işlemi sırasında oluşan kabarcıklar kaldırmak için 15 dakika boyunca gazlar PMMA ana üstüne döktü.
6. Tüm kabarcıklar kaldırıldığında, PDMS bir tesviye 85 ° C fırında polimerizasyon için bir saat içinde alınır.
7. Bir kez PDMS tam kürünü, PDMS ana PMMA ana sıyrılır ve 2-3 damla trichlorosilane bir desikatöre içine yerleştirilir ve buhar mont için 15 dakika PDMS ana yüzey için vakumlu. Trichlorosilane kaplama PDMS ustadan son PDMS nöron co-kültür cihazlar piyasaya kolaylaştırır. PDMS ana kaplama sonra, kısa bir süre aşırı trichlorosilane kaldırmak için izopropil alkol ile durulanır, ve N ₂ gazı ile kurutulur.

Bölüm 2: Nöron kültürü cihaz çoğaltma

1. 1 kilo: PDMS pre-polimer (Sylgard 184) 10 oranında sertleştirici ile karıştırılır.
2. PDMS karışımı PDMS ustanın üstüne dökülür ve 15 dakika boyunca bir vakum pompasına bağlı bir desikatöre içindeki gazlar. Bu master üzerindeki 3,5 mm yüksek PDMS yapısı tamamen dalmış, böylece çok PDMS dökmek için önemlidir.
3. Tüm kabarcıklar kaldırıldığında, PDMS bir tesviye 85 ° C fırında polimerizasyon için bir saat içinde alınır.
4. PDMS bir saat sonra fırından çıkarılır ve oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Sonra yavaşça PDMS ana PDMS nöron kültürü cihazları sıyrılır. PDMS aygıtları kapatın Soyulmuş toz veya enkaz onları korumak için parafilm ile sarılır.
5. Parafilm ile sarılmış PDMS cihazlar, bir bıçak ile donatılmış bir matkap basın kullanarak tek tek parçalar halinde kesilir.

Bölüm 3: Cihaz montaj

1. PDMS nöron kültürü cihaz plazma süpürge içine yerleştirilen ve PDMS cihazın yüzeyi hidrofilik yapmak için, 90 saniye süreyle hava plazma maruz. Bu plazma tedavisi, poli-d-lizin kaplı yüzeye montaj sonrası kültür ortamı ile doldurulması gereken mikro kolaylaştıracaktır.
2. Plazma ile tedavi edilen cihazlar sterilizasyonu için 30 dakika sonra% 70 etanol içinde batırılır ve sterilize biyo-luk içinde taşındı.
3. Steril cihazlar% 70 etanol çıkarılan ve Millipore süzülmüş N ₂ gazı ile kurutulur. Kurutulmuş cihazlar 6-iyi bir kültür plaka ve hafif basınç substrat ve aygıt arasında sızdırmazlık sağlamak için uygulanan poli-d-lizin kaplı polistiren üstüne yerleştirilir.
4. Kültür medya sonra altı akson / glia bölmeleri doldurarak takip soma bölmesi içine doldurulur. Bu mikro baloncuklar içinde kalmış olduğundan emin olmak için kültür ortamı soma bölmesine ekledikten sonra akson / glia bölmeleri doldurmadan önce 1-2 dakika ara vermek daha iyidir.
5. Cihazlar kültür ortamı ile dolu bir 37 ° C inkübatör gecede olası enkaz veya zehirli kalıntı durulama içinde inkübe edilir.

Bölüm 4: Hücre yükleme ve nöron-oligodendrosit ko-kültür

1. 16-18 sıçanlarda hücre kültürü ilk gününde, birincil ön beyin nöron hücreleri embriyonik günden itibaren bir alan yoğunluğu 500 hücre / mm ² soma bölmesi içine yüklenir. Birincisi, kültür ortamı içinde soma bölmesi ve akson / glia bölmeleri hem hücre yükleme öncesinde pipet kullanarak aspire edilir. Daha sonra, kültür ortamları 40 ul seyreltilmiş 38500 hücreler, Mikrokanallı girişler etrafında soma bölmesine yüklenir. Cihaz ve yüzey arasındaki mühür kırmak, çünkü hücreleri yüklenirken PDMS Cihazın dokunmatik önemlidir.
2. Yüzey hücre yapışmasını geliştirmek için, 30 dakika içinde 37 ° C inkübatör için hücre yüklü cihazlar inkübe edin. Inkübasyondan sonra, tüm bölmeleri kültür ortamı ile doldurulur.
3. Hücreler 37 kültüre ° C nemlendirilmiş _bir% 5 CO2 inkübatör ve kültür ortamı sadece yarısı, 3-4 günde bir değiştirilir.
4. 14 gün sonra in vitro nöron kültürü, oligodendrosit ko-kültür akson / glia bölmeleri eklenir. Postnatal günde 1-2 adet Sprague-Dawley rat hemisferlerin disseke oligodendrosit, 1000 hücre / mm ^{2 'lik} bir alanı yoğunlukta her bir akson / glia bölmesine eklenir . Yükleme öncesi hücreler, kültür medya bölmeleri içinde yaklaşık% 60 pipet ile aspire edilir. Dikkat, bu yüzey üzerinde oluşan aksonal ağ zarar verebilir bu yana alt substrat dokunmamaya yapılmalıdır. Daha sonra, kültür ortamı 5 ul seyreltilmiş 6700 oligodendrosit hücreleri, akson / glia bölmelere eklenir. Hücreler 1 saat süreyle inkübe ve bölmeleri kültür medya ile doldurulur.
5. Hücreler 37 kültüre ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO ₂ kuvöz ve sadece kültür ortamı yarısı iki hafta daha süre için her 3-4 günde bir değiştirilir .

Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:

Deneylerde düzgün bir şekilde yapılırken, soma bölmesi yüklenen nöron hücreleri kültür 1 hafta sonra akson / glia bölmeleri içinde Mikrokanallı giriş ve aksonal katmanı yakın bulmak. Soma bölmesindeki nöron hücre agregasyonu Ol hücreleri sağlıklı olmadığı bir göstergesi olabilir. Nöron kültürü iki hafta sonra oligodendrosit yüklerken, akson / glia bölmeleri, akson ve oligodendrosit yoğun bir tabaka ile kaplanmış olmalıdır aksonal tabakasının üstüne yüklenmiş olması gerekir.

Şekil 1 yüksek verimli mikroakışkan çok bölmesi MSS nöron ko-kültür platformu şematik çizimler. Aksonlar nöronal soma ve dendritler yanı sıra dakika akışkan seviye farkı ile bölmeleri arasında akışkan izolasyonu izolasyonu gösteren kesitsel görünümü. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Şekil 2 çok bölmesi İmalat ve montaj adımları PDMS mikroakışkan co-kültür cihaz. Her aygıt, geleneksel bir 6-iyi polistiren hücre kültürü plaka iyi bir sığar. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Biz memeli MSS akson glia etkileşim çalışmak için çok bölmesi ko-kültür platformu geliştirdi. MSS aksonlar nöronal hücre gövdeleri / dendritler başarıyla izole edildi ve oligodendrosit cihazın içinde başarılı bir ortak kültüre edildi. Nöron yoğunluklu uygulamalar tarafından çeşitli olabilir, ama çok düşük veya çok yüksek konsantrasyon hücrelerinin ölmesine neden olabilir. Ayrıca, yüzey hücreleri veya aksonal katmanı zarar böylece kültür ortamı sadece yarısını değiştirmek için önemlidir. Biz bu sistemin, merkezi sinir sistemi glia akson-in-vitro sinyalizasyon ağları çalışmak için güçlü bir araç olduğu ve miyelinasyonun ve miyelin onarım teşvik tarama büyüme faktörleri veya potansiyel ilaç adayları için yüksek verimli bir platform doğru bir yol sağlayacak bekliyoruz.