En flera brandceller CNS Neuron-Glia Co-kulturen mikroflödessystem plattform

Summary

Vi utvecklade en roman med flera fack neuron co-kulturen mikrosystem plattform för in vitro CNS axon-Glia samspelet forskning. Plattformen är kapabel att genomföra upp till sex oberoende experiment parallellt och var fabricerade med hjälp av en nyutvecklad makro / mikro-hybrid tillverkning metod.

Abstract

Vi presenterar en roman med flera fack neuron co-kulturen mikrosystem plattform för in vitro CNS axon-Glia samspelet forskning, som kan utföra upp till sex oberoende experiment parallellt för högre genomströmning. Vi utvecklade en ny tillverkningsmetod för att skapa mikroflödessystem anordningar som har både mikro och makro skala strukturer inom samma enhet genom en enda mjuk litografi processen, så att massan tillverkning med god repeterbarhet.

I flera brandceller mikroflödessystem co-kultur-plattformen består av en Soma fack för nervceller och sex axonet / Glia fack för oligodendrocyter (OLS). Den soma facket och axon / Glia fack är sammanbundna med kedjor av Axon-vägledande mikrokanaler som fungerar som fysiska hinder för att begränsa neuronala soma i soma facket, samtidigt som axoner att växa till Axon / fack Glia. OLS laddas in i axonet / Glia fack kan interagera bara med axoner, men inte med neuronala soma eller dendriter, så lokaliserade axon-Glia interaktionsstudier. Den mikrokanaler gjorde också fluidic isolation mellan fack, så att sex oberoende experiment ska utföras på en enda enhet för högre genomströmning.

Soft-litografi med hjälp av poly (dimetylsiloxan) (PDMS) är en ofta använd teknik inom biomedicinsk microdevices. Reservoarer på dessa enheter ofta definieras genom manuell stansning. Även enkla, dålig anpassning och tidskrävande karaktären i processen gör att processen inte är lämplig när ett stort antal dammar måste upprepade gånger skapas. Den nyutvecklade metoden inte kräver manuell stansning av reservoarer, övervinna sådana begränsningar. Först, sju reservoarer (djup: 3,5 mm) gjordes på en poly (polymetylmetakrylat) (PMMA)-block med hjälp av en mikro-fräsmaskin. Då var kedjor av åsen mikrostrukturer, monterad på ett glassubstrat, varm-relief mot PMMA blocket för att definiera mikrokanaler att ansluta soma och axon / Glia fack. Denna process resulterade i makronivå magasin (3,5 mm) och mikro-skala kanaler (2,5 mikrometer) som sammanfaller i en enda PMMA mästare. Ett PDMS replik som fungerade som en form mästare erhölls genom att använda mjuk litografi och den slutliga PDMS enheten var replikeras från denna herre.

Primär nervceller från E16-18 råttor lastades till soma facket och odlade i två veckor. Efter en vecka av cellodling, korsade axoner mikrokanaler och bildade axonal bara nätverkslagret inne axonet / Glia fack. Axoner blev enhetligt i hela sex axonet / Glia fack och OLS från P1-2 råttor har lagts till Axon / Glia fack på 14 dagar in vitro för samarbetet kultur.

Protocol

Del 1: Förbereda en mästare form för flera brandceller neuron co-kultur Komponentframställning

1. Första steget att fabricera PMMA-mästare är att 3,5 mm djupa fack. Ett soma fack och sex axonet / Glia fack definieras på ett PMMA blocket med hjälp av en mikro-fräsmaskin (MDX-40, Roland eller någon annan CNC-maskin). PMMA master är sedan sonicated i isopropylalkohol i 10 minuter för att ta bort skräp.
2. Kedjor av 2,5 ìm hög ås strukturer mönstrade på en 50,8 mm x 50,8 bildspel mm glas med en standard fotolitografi process, följt av våtetsning av glaset.
   Först är samling av åsen strukturer mönstrade på en rengjord glassubstrat med positiv fotoresist S1818 med fotolitografi. S1818 är spin-belagd på substratet (4000 rpm), mjuk baserat på 110 ° C i 5 min och därefter utsätts för UV-ljus (84 mJ / cm ²⁾ med hjälp av en mask Aligner följt utvecklingen av fotoresist i MF319 för 40 sekunder. Därefter är det fotoresist mönstrat glas substrat som är inbakat i buffrad oxid etch (BOE) i rumstemperatur i 6-7 minuter för att få en 2,5 ìm hög ås strukturer. Slutligen är fotoresist skiktet avlägsnas med aceton och isopropylalkohol, följt av noggrann sköljning i avjoniserat (DI) vatten.
3. Glassubstrat med mikro-åsen strukturer är hot-präglade mot PMMA befälhavaren att överföra sin mönster.
   Först är PMMA mögel master och substrat glas manuellt justeras och placeras på en varm-press. Då är temperaturen höjs till 115 ° C. När önskad temperatur är nådd, 0,5 ton riskvikt i 5 minuter. Efter 5 minuter är temperaturen kyls ner till 40 ° C och trycket är släppt. PMMA-mästare skärs sedan till en 50,8 mm x 50,8 mm storlek block.
4. PDMS pre-polymer (Sylgard 184) blandas med härdare i förhållandet 10: 1 i vikt.
5. PMMA mästare är placerad inuti ett fat och PDMS blandningen hälls ovanpå PMMA befälhavaren att fabricera ett PDMS mästare. Det är sedan placeras i en exsickator ansluten till en vakuumpump. PDMS hälls ovanpå PMMA mästare sedan avgasas i 15 minuter för att ta bort bubblor som genereras under PDMS blandningsprocessen.
6. När alla bubblor har tagits bort, är PDMS sätta in en planade 85 ° C ugn i en timme för polymerisation.
7. När PDMS är helt botad, är PDMS mästare skalas av från PMMA master och placeras i exsickator med 2-3 droppar Trichlorosilane och dammsugas i 15 minuter för att ånga belägga PDMS mästare ytan. Trichlorosilane beläggning underlättar frisläppandet av den sista PDMS neuron co-kultur enheter från PDMS mästare. När beläggningen är PDMS mästare kort sköljas med isopropylalkohol för att ta bort alltför Trichlorosilane, och torkas med N ₂ gas.

Del 2: Neuron kultur enhet replikering

1. PDMS pre-polymer (Sylgard 184) blandas med härdare i förhållandet 10: 1 i vikt.
2. PDMS blandningen hälls ovanpå PDMS master och avgasade inne i en exsickator ansluten till en vakuumpump i 15 minuter. Det är viktigt att inte hälla för mycket PDMS så att 3,5 mm höga PDMS struktur på master inte är helt nedsänkt.
3. När alla bubblor har tagits bort, är PDMS sätta in en planade 85 ° C ugn i en timme för polymerisation.
4. PDMS tas ut ur ugnen efter en timme och stå i rumstemperatur att svalna. Sedan är PDMS neuron kultur enheter försiktigt skalas av från PDMS mästare. Skalade av PDMS-enheter är lindade med parafilm att skydda dem från damm och skräp.
5. PDMS-enheter, lindade med parafilm, skärs i individuella bitar med hjälp av en borr press utrustad med en kniv.

Del 3: Enhet montering

1. PDMS neuron kultur enheten är placerad inuti plasma renare och utsätts för luft plasma i 90 sekunder för att göra ytan av PDMS-enheten hydrofila. Denna plasma-behandling kommer att underlätta mikrokanaler att fyllas med kultur media efter montering poly-D-lysin belagda substrat.
2. Enheter som behandlas med plasma därefter ned i 70% etanol i 30 minuter för sterilisering och flyttade in i steriliserade bio-huva.
3. Steriliserade enheter tas ut från 70% etanol och torkas med Millipore filtrerad N ₂ gas. Torkade produkterna släpps ut på toppen av poly-D-lysin belagda polystyren 6-bra kultur platta och lätt tryck appliceras för att säkerställa tätningen mellan substrat och enheten.
4. Kultur medier Därefter fylls i soma facket, följt av att fylla de sex axonet / Glia fack. Det är bättre att ge 1-2 minuter paus innan du fyller axonet / Glia fack efter att ha lagt kultur media till Soma facket att se till att inga bubblor är fångade i mikrokanaler.
5. Enheter fylld med kultur media inkuberas inne i en 37 ° C inkubator natten att skölja eventuella skräp eller giftiga rester.

Del 4: Cell lastning och neuron-oligodendrocyte co-kultur

1. På den första dagen av cellodling, 16-18 råttor primära framhjärnan neuron celler från embryonala dagen läses in i Soma fack vid en ytdensitet på 500 celler / mm ^2. Först är odlingssubstrat inne både soma facket och axon / Glia fack aspirerade med pipett innan cellen lastning. Då är 38.500 celler, utspädd i 40 ìl kulturmedia laddad till soma utrymmet runt mikrokanalplatta vikar. Det är viktigt att inte röra PDMS enheten medan du laddar cellerna, eftersom det kan bryta förseglingen mellan enheten och underlaget.
2. Inkubera cellen laddade enheter i 30 minuter inne i en 37 ° C inkubator för att öka cell adhesion till underlaget. Efter inkubation är alla fack fyllda med kultur media.
3. Cellerna odlas vid 37 ° C i en fuktig 5% CO ₂ inkubator och bara hälften av odlingssubstrat byts ut varje 3-4 dagar.
4. Efter 14 dagar av neuron kultur in vitro, är oligodendrocyter läggs till axonet / Glia fack för co-kultur. Oligodendrocyter, dissekerade från hjärnhalvorna för Sprague-Dawley råttor vid födseln dag 1-2, läggs till varje Axon / Glia fack vid ett område täthet på 1000 celler / mm ^2. Före lastning celler, är cirka 60% av odlingssubstrat inne i fack aspirerade med pipett. Försiktighet måste göras inte röra bottensubstratet, eftersom det kan skada axonal nätverk bildas på substratet. Sedan är 6700 oligodendrocyte celler, utspädd i 5 ìl kulturmedia läggs till axonet / Glia fack. Cellerna inkuberas under 1 timme och fack är fyllda med kultur media.
5. Cellerna odlas vid 37 ° C i en fuktig 5% CO ₂ inkubator och bara hälften av odlingssubstrat byts ut var 3-4 dagar för två veckor.

Del 5: representativa resultat:

När experiment genomförs korrekt, neuron celler laddad till Soma facket lokalisera nära mikrokanalplatta vikar och axonal lagret börjar på insidan axonet / Glia fack efter 1 vecka av kultur. Skriv av neuron cell aggregering inuti Soma facket kan vara en indikation på att cellerna inte är friska. När du laddar oligodendrocyter efter två veckors neuron kultur, axonet / Glia fack täckas med täta lager av axoner och oligodendrocyter ska läggas på toppen av axonal lagret.

Figur 1. Schematisk illustrationer av hög genomströmning mikroflödessystem flera brandceller CNS neuron co-kultur-plattform. Tvärsnitt som visar isolering av axoner från neuronala soma och dendriter samt fluidic isolering mellan fack med min fluidic nivåskillnad. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2. Fabrication och steg montering för flera brandceller PDMS mikroflödessystem co-kultur-enhet. Varje enhet passar in i en brunn i en vanlig 6-och polystyren cellodling plattan. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Discussion

Vi har utvecklat en flera brandceller co-kultur plattform för att studera däggdjurs CNS axon-Glia interaktion. CNS axoner framgångsrikt isolerade från neuronal cell organ / dendriter och oligodendrocyter framgångsrikt samarbete odlade inuti enheten. Neuron densitet kan varieras genom tillämpningar, men för låg eller för hög koncentration kan orsaka cellerna att dö. Dessutom är det viktigt att ändra bara hälften av odlingsmedia så att cellerna eller axonal skikt på underlaget inte är skadade. Vi förväntar oss att detta system kommer vara ett kraftfullt verktyg för att studera CNS axon-Glia signalering nätverk in vitro och ger en väg mot en hög genomströmning plattform för faktorer screening tillväxt eller potentiella kandidater drog som främjar myelination och myelin reparation.