Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique

Summary

Nous avons développé une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture in vitro du système nerveux central de recherche interactions axone-glie. La plateforme est capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle et a été fabriqué en utilisant un tout nouveau micro / macro méthode de fabrication hybride.

Abstract

Nous présentons une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture dans la recherche in vitro l'interaction du système nerveux central axone-glie, capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle pour débit plus élevé. Nous avons développé un procédé de fabrication afin de créer de nouveaux dispositifs microfluidiques ayant structures à l'échelle micro et macro dans le même dispositif à travers un simple processus de lithographie douce, permettant la fabrication de masse avec une bonne répétabilité.

Le multi-compartiments microfluidique plateforme de co-culture est composé d'un compartiment soma des neurones et six axone / glie compartiments pour les oligodendrocytes (OL). Le compartiment soma et axone / glie compartiments sont reliés par des réseaux de microcanaux de guidage des axones qui fonctionnent comme des barrières physiques pour confiner le soma des neurones dans le compartiment soma, tout en permettant aux axones de se développer en axone / compartiments glie. OL chargé dans l'axone / glie compartiments peuvent interagir uniquement avec les axones, mais pas avec le soma des neurones ou des dendrites, permettant des études d'interactions localisées axone-glie. Les microcanaux ont également permis l'isolement fluidique entre compartiments, laissant six expériences indépendantes pour être menée sur un seul dispositif pour un débit plus élevé.

Soft-lithographie utilisant le poly (diméthylsiloxane) (PDMS) est une technique couramment utilisée dans microdispositifs biomédicale. Réservoirs sur ces dispositifs sont communément définis par poinçonnage manuel. Bien que simple, un mauvais alignement et la nature du temps du processus rend ce processus ne convient pas quand un grand nombre de réservoirs doivent être reprises créé. La méthode nouvellement développée n'exigeait pas la perforation manuelle de réservoirs, de surmonter ces limitations. Tout d'abord, sept réservoirs (profondeur: 3,5 mm) ont été faites sur un poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) de bloc en utilisant une machine de fraisage une micro-. Ensuite, les tableaux de microstructures crête, fabriqué sur un substrat de verre, ont été à chaud en relief contre le bloc de PMMA de définir des microcanaux qui relient le soma et axone / glie compartiments. Ce processus a abouti à l'échelle macro-réservoirs (3,5 mm) et micro-échelle des canaux (2,5 um) pour coïncider avec un seul maître de PMMA. Une réplique de PDMS qui a servi en tant que maître moule a été obtenue en utilisant lithographie douce et le dispositif final PDMS a été reproduite à partir de ce maître.

Neurones primaires de rat E16-18 ont été chargés dans le compartiment soma et cultivées pendant deux semaines. Après une semaine de culture cellulaire, les axones traversé microcanaux et a formé des axones de la couche réseau seulement à l'intérieur des axones / glie compartiments. Les axones a grandi de façon uniforme partout dans six axone / glie compartiments et LO de P1-2 rats ont été ajoutés à l'axone / glie compartiments moins 14 jours in vitro pour la co-culture.

Protocol

Partie 1: Préparation d'un moule maître pour le multi-compartiment de fabrication de neurones périphériques de co-culture

1. Première étape pour fabriquer le maître PMMA est de faire de 3,5 mm compartiments profonds. Un compartiment soma et six axone / glie compartiments sont définies sur un bloc de PMMA en utilisant une machine de fraisage une micro-(MDX-40, Roland ou tout autre fraiseuse CNC). PMMA maître est ensuite soniquée dans l'alcool isopropylique pendant 10 minutes pour enlever les débris.
2. Des tableaux de structures um 2,5 haute crête sont modelés sur un mm 50,8 x 50,8 mm lame de verre par un procédé de photolithographie standard, suivi par gravure humide du verre.
   Tout d'abord, tableau de structures dorsale sont calqués sur un substrat de verre nettoyé avec positifs résine photosensible S1818 en utilisant la photolithographie. S1818 est spin-enduit sur ​​le substrat (4000 rpm), douce basée à 110 ° C pendant 5 min, puis exposé à la lumière UV (84 mJ / cm ²⁾ en utilisant un masque de aligneur suivie par l'élaboration de la résine dans le MF319 pour 40 secondes. Ensuite, le substrat photorésine verre imprimé est immergé dans de l'oxyde tamponné etch (BOE) à température ambiante pendant 6-7 minutes pour obtenir un 2,5 um structures dorsale haute. Enfin, la couche de résine est enlevé par de l'acétone et l'alcool isopropylique, suivi d'un rinçage complet en dé-ionisée (DI).
3. Substrat en verre avec des micro-structures dorsale est chaud-relief contre le maître de PMMA de transférer ses habitudes.
   Premièrement, le maître moule PMMA et des substrats de verre sont alignés manuellement et placés sur une presse à chaud. Ensuite, la température est élevée à 115 ° C. Une fois la température souhaitée est atteinte, 0,5 tonnes de poids est appliqué pendant 5 minutes. Après 5 minutes, la température est abaissée à 40 ° C et la pression est relâchée. Le maître de PMMA est ensuite découpé en mm 50,8 x 50,8 mm taille du bloc.
4. PDMS pré-polymère (Sylgard 184) est mélangé avec l'agent de durcissement au ratio de 10: 1 en poids.
5. PMMA maître est placé à l'intérieur un tonneau et le mélange PDMS est versé sur le dessus du maître PMMA pour fabriquer un maître PDMS. Il est ensuite placé dans un dessiccateur reliée à une pompe à vide. PDMS versé sur le dessus de PMMA maître est ensuite dégazée pendant 15 minutes pour enlever les bulles générées pendant le processus de mélange PDMS.
6. Lorsque toutes les bulles sont éliminées, le PDMS est mis à l'intérieur d'un four nivelé 85 ° C pendant une heure pour la polymérisation.
7. Une fois PDMS est complètement durci, le PDMS maître est décollée du maître PMMA et placé dans un dessiccateur avec 2-3 gouttes de trichlorosilane et l'aspirateur pendant 15 minutes à la vapeur recouvrir la surface de PDMS maître. Revêtement Trichlorosilane facilite la libération de la finale de PDMS neurone de co-culture des dispositifs du maître PDMS. Après le revêtement, le maître de PDMS est brièvement rincée avec de l'alcool isopropylique pour enlever trichlorosilane excessive, et séché avec gaz N _2.

Partie 2: réplication Neuron dispositif de culture

1. PDMS pré-polymère (Sylgard 184) est mélangé avec l'agent de durcissement au ratio de 10: 1 en poids.
2. Mélange de PDMS est versé sur le dessus du maître PDMS et dégazé dans un dessicateur relié à une pompe à vide pendant 15 minutes. Il est important de ne pas verser trop de PDMS afin que les 3,5 mm sur la structure de haut PDMS le maître n'est pas complètement immergé.
3. Lorsque toutes les bulles sont éliminées, le PDMS est mis à l'intérieur d'un four nivelé 85 ° C pendant une heure pour la polymérisation.
4. PDMS est sorti du four après une heure et laissé à température ambiante pour refroidir. Ensuite, les dispositifs en PDMS la culture de neurones sont délicatement décollée du maître PDMS. Peler les dispositifs en PDMS sont enveloppés avec du parafilm pour les protéger des poussières ou des débris.
5. Appareils PDMS, enveloppé avec du parafilm, sont coupés en morceaux individuels à l'aide d'une perceuse équipée d'une lame.

Partie 3: Dispositif de montage

1. Dispositif de PDMS la culture de neurones est placé à l'intérieur du filtre plasma et exposé à l'air du plasma pendant 90 secondes pour rendre la surface de l'appareil PDMS hydrophile. Ce traitement par plasma facilitera microcanaux à être rempli de milieux de culture après le montage à la poly-D-lysine substrat enduit.
2. Périphériques traités avec du plasma sont ensuite plongées dans de l'éthanol 70% pendant 30 minutes pour la stérilisation et déplacé à l'intérieur du capot de la bio-stérilisés.
3. Appareils stérilisés sont prises à partir d'éthanol à 70% et séché avec Millipore filtrée gaz N _2. Appareils secs sont placés sur le dessus de la poly-D-lysine en polystyrène recouvert de 6 puits plaque de culture et une légère pression est appliquée pour assurer l'étanchéité entre le substrat et le périphérique.
4. Milieux de culture est ensuite introduit dans le compartiment soma, suivie d'un remplissage des six axone / glie compartiments. Il est préférable de donner 1-2 minutes de pause avant de remplir axone / glie compartiments après l'ajout de milieux de culture pour le compartiment Soma pour s'assurer qu'aucune bulle sont piégés dans les microcanaux.
5. Périphériques rempli de milieux de culture est incubée au sein d'une pépinière à 37 ° C durant la nuit pour se rincer les débris possibles ou de résidus toxiques.

Partie 4: Chargement des cellules et des neurones-oligodendrocytes de co-culture

1. Le premier jour de la culture cellulaire, des cellules primaires de neurones du cerveau antérieur du jour embryonnaire 16-18 rats sont chargés dans le compartiment le soma à une densité surfacique de 500 cellules / mm ^2. Tout d'abord, les milieux de culture à l'intérieur du compartiment à la fois soma et axone / glie compartiments sont aspirées à l'aide la pipette avant le chargement de la cellule. Puis, les cellules 38500, diluée dans 40 pl de milieu de culture, sont chargés dans le compartiment autour du soma entrées microcanal. Il est important de ne pas toucher l'appareil pendant le chargement des PDMS cellules, car elle peut briser l'étanchéité entre le dispositif et le substrat.
2. Incuber les cellules périphériques chargés pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 ° C pour améliorer l'adhérence des cellules au substrat. Après incubation, tous les compartiments sont remplis de milieux de culture.
3. Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO ₂ incubateur et seulement la moitié des milieux de culture est changé sur tous les 3-4 jours.
4. Après 14 jours de culture in vitro de neurones, les oligodendrocytes sont ajoutés aux compartiments axone / glie pour la co-culture. Oligodendrocytes, disséqué par les hémisphères cérébraux des rats Sprague-Dawley au jour postnatal 1-2, sont ajoutés à chaque compartiment axone / glie à une densité surfacique de 1000 cellules / mm ^2. Avant de cellules de chargement, environ 60% des milieux de culture dans les compartiments sont aspirés avec pipette. Attention doit être fait de ne pas toucher le substrat du fond, car il peut endommager le réseau des axones formés sur le substrat. Puis, 6700 oligodendrocytes, dilué dans 5 ul de milieux de culture, sont ajoutés aux compartiments axone / glie. Les cellules sont incubées pendant 1 heure et compartiments sont remplis avec des milieux de culture.
5. Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO ₂ incubateur et seulement la moitié des milieux de culture est changé tous les 3-4 jours à deux semaines de plus.

Partie 5: Résultats du représentant:

Lorsque les expériences sont menées correctement, les cellules neuronales chargé pour le compartiment Soma localiser près de criques à microcanaux et la couche axonale commencent à se former à l'intérieur du compartiment axone / glie après 1 semaine de la culture. Signe de l'agrégation cellulaire des neurones à l'intérieur du compartiment à Soma peut être une indication que les cellules ne sont pas sains. Lors du chargement des oligodendrocytes, après deux semaines de culture neurone, axone / glie compartiments doivent être couverts d'une couche dense de axones et des oligodendrocytes doivent être chargés sur le dessus de la couche d'axonal.

Figure 1. Illustrations schématique de la microfluidique à haut débit multi-compartiments du SNC neurone plateforme de co-culture. Vue en coupe montrant l'isolement des axones neuronaux du soma et des dendrites ainsi que l'isolement fluidique entre compartiments avec différence de niveau minute fluidiques. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.

Figure 2. Fabrication et étapes de montage pour le compartiment multi-PDMS microfluidique dispositif de co-culture. Chaque périphérique s'intègre dans un puits d'une classique 6-même plaque de culture cellulaire polystyrène. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2.

Discussion

Nous avons développé un compartiment multi-plateforme de co-culture pour l'étude des mammifères SNC axone-glie interaction. Axones du SNC ont été correctement isolé de cellules neuronales organismes / dendrites, et les oligodendrocytes ont été co-cultivées avec succès à l'intérieur du dispositif. La densité des neurones peut être modifiée par les applications, mais la concentration trop faible ou trop élevé peut provoquer la mort des cellules. Aussi, il est important de changer seulement la moitié des milieux de culture afin que les cellules ou couche axonale sur le substrat ne sont pas endommagés. Nous prévoyons que ce système sera un outil puissant pour étudier SNC axone-glie réseaux de signalisation in vitro et fournir un chemin vers une plateforme à haut débit pour le dépistage des facteurs de croissance ou de candidats médicaments potentiels qui favorisent la myélinisation et réparation de la myéline.