一个多室中枢神经系统的神经胶质细胞共培养的微流体平台

Summary

我们开发了一种新型的多舱的神经元共培养的微平台，在体外培养的中枢神经系统的轴突神经胶质细胞相互作用的研究。该平台能够进行多达6个独立并行实验，并采用新开发的宏观/微观混合制备方法。

Abstract

我们目前在体外中枢神经系统轴突的神经胶质细胞相互作用的研究一种新型的神经元多室共培养微平台，能够进行高通量平行的6个独立的实验。我们开发了一种新的制造方法，以建立具有微观和宏观尺度的结构，通过一个单一的软光刻工艺相同设备内的微流体装置，使大规模制造，具有良好的重复性。

多室微合作文化的平台是一个神经元轴突/神经胶质细胞和少突胶质细胞（OLS）6车厢SOMA车厢组成。 SOMA舱和轴突/神经胶质细胞车厢连接阵列轴突指导微函数作为物理屏障只在SOMA车厢中的神经元胞体，同时允许轴突轴突/神经胶质细胞车厢长成。装入轴突/神经胶质细胞车厢的OLS可以交互只与但不与神经元的胞体或树突的轴突，使局部轴突的神经胶质细胞相互作用的研究。微也使车厢之间的流体隔离，允许6个独立的实验，以一个单一的设备上进行更高的吞吐量。

使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的软光刻技术在生物医学常用的微型器件。在这些设备上的水库，通常定义的手动冲床。虽然简单，穷人的路线和时间费时的过程，使得这个过程中不适合时，大量的水库已被反复创建。新开发的方法并不需要手动冲压水库，克服这些局限性。首先，7个水库（深：3.5毫米），上一聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）使用的微型铣床块。然后，脊微观结构的阵列，在玻璃基板上制造，对有机玻璃块定义胞体和轴突/神经胶质细胞车厢连接的微热压印。这个过程导致了宏观尺度的水库（3.5毫米）和微观尺度通道（2.5微米），在一个单一的聚甲基丙烯酸甲酯主不谋而合。一个PDMS的副本作为一个模具师傅用软光刻技术和最终的PDMS设备是从这个主复制。

E16 - 18只大鼠的初级神经元被装到SOMA室和培养两个星期。细胞培养一周后，轴突越过微，形成轴突轴突/神经胶质细胞车厢内唯一的网络层。整个六轴突/ P1 - 2只大鼠神经胶质细胞车厢和OLS均匀轴突增长在14 天的体外补充轴突/神经胶质细胞车厢的共同培养。

Protocol

第1部分：准备多室模具主神经元共培养设备制造

1. 制备聚甲基丙烯酸甲酯主的第一步是使3.5毫米深的舱室。 SOMA舱和六个轴突/神经胶质细胞车厢定义有机玻璃块使用一个微型铣床（MDX - 40，罗兰或任何其他数控铣床）。聚甲基丙烯酸甲酯的主人是那么超声异丙醇10分钟，以清除杂物。
2. 2.5微米高脊线结构的数组是一个标准的光刻工艺50.8毫米x 50.8毫米，湿蚀刻玻璃载玻片上图案。
   首先，脊结构的数组与正光阻S1818清洗玻璃基板使用光刻图案。 S1818是旋涂在基板上（4000转），软在110 ° C为5分钟，然后暴露在紫外光灯（84兆焦耳/厘米^2）使用光刻MF319光刻胶发展40秒。下一步，光致抗蚀剂图案的玻璃基板是沉浸在缓冲氧化层蚀刻（BOE）为6-7分钟，获得一个2.5微米高脊结构在室温下。最后，除去丙酮和异丙醇的光阻层，其次是在去离子（DI）水彻底​​冲洗。
3. 对PMMA主转让其模式与微脊结构的玻璃基板热压花。
   首先，PMMA模具师傅和玻璃基板手动对齐和放置一个热压。然后，将温度提高到115 ° C。一旦达到所需的温度，适用于0.5吨的重量是5分钟。 5分钟后，温度被冷却到40 ° C和压力释放。聚甲基丙烯酸甲酯主，然后切成50.8毫米× 50.8毫米大小的块。
4. PDMS预聚物（Sylgard 184）混合​​与固化剂的比例在10：按重量1。
5. 聚甲基丙烯酸甲酯的主人是放在一个木桶和PDMS的混合物浇聚甲基丙烯酸甲酯主上编造的PDMS主。然后放置在连接到真空泵的干燥器。 PDMS的倒在聚甲基丙烯酸甲酯主的顶部，然后是15分钟脱气，以消除在PDMS搅拌过程中产生的气泡。
6. 当所有的泡沫都将被删除，PDMS的一个拉平85 ° C烘箱内为一小时聚合。
7. 一旦PDMS完全治愈，PDMS的主剥下从PMMA主置于干燥器2-3滴的三氯内，15分钟的蒸汽大衣的PDMS主表面吸尘。三氯氢硅涂层，有利于最终PDMS的神经元共培养，从PDMS主设备释放。是简单地冲洗后的PDMS主涂层，异丙醇去除过量的三氯氢硅，并_与 N 2气体干燥。

第2部分：神经元的文化设备复制

1. PDMS预聚物（Sylgard 184）混合​​与固化剂的比例在10：按重量1。
2. PDMS的混合物倒入的PDMS主上，并连接到一个15分钟的真空泵的干燥器内脱气。这一点很重要，不要倒太多的PDMS，使3.5毫米高的PDMS主结构是不完全沉浸。
3. 当所有的泡沫都将被删除，PDMS的一个拉平85 ° C烘箱内为一小时聚合。
4. 硅橡胶是从烤箱中取出一小时后，在室温下冷却下来。然后，PDMS的神经元的文化设备轻轻揭下从PDMS主。剥落的PDMS设备包装用封口膜，以保护他们免受灰尘或杂物。
5. PDMS的设备，用封口膜包裹，切成各个部分使用一台钻床配备一个刀片。

第3部分：设备组装

1. PDMS的神经元培养装置被放置在等离子体清洁和空气等离子暴露90秒钟，以使表面亲水性的PDMS设备。此等离子体处理将有利于文化传媒充满- D -聚赖氨酸涂层基板组装后的微通道。
2. 等离子体处理的设备，然后在70％的乙醇浸泡30分钟进行杀菌和消毒的生物引擎盖内移动。
3. 消毒设备是从70％乙醇和微孔过滤N ₂气体的干燥。适用于6孔培养板和温和的压力，以确保基板和设备之间的密封，干燥设备被放置在聚- D -赖氨酸涂层的聚苯乙烯顶部。
4. 文化传媒，然后填充到SOMA舱，填补了六个轴突/神经胶质细胞车厢。最好是给1-2分钟灌装前轴突/神经胶质细胞后加入培养基SOMA车厢，以确保无气泡内的微被困车厢的暂停。
5. 充满文化传媒的设备内的37 ° C培养箱中过夜冲洗任何可能的碎片或有毒残留物孵育。

第4部分：细胞装载和神经元，少突胶质细胞共培养

1. 在第一天的细胞培养，原发性脑的神经细胞从胚胎一天16-18大鼠加载到SOMA车厢的500个细胞^/平方毫米的磁录密度。首先，SOMA车厢和轴突/神经胶质细胞车厢内的文化传媒细胞加载之前使用吸管吸气。然后，38500细胞，在40μL培养基稀释，被加载到微进气口周围的SOMA车厢。重要的是不要触摸的PDMS设备，同时加载的细胞，因为它可以打破设备和基板之间的密封。
2. 孵育30分钟内的37℃培养箱中培养的细胞加载装置，以提高细胞对基材的附着力。孵化后，所有的车厢都充满了文化传媒。
3. 细胞培养于37 ° C和饱和湿度_5％CO2培养箱中只有一半是文化传媒改为每3-4天。
4. 经过14天在体外培养的神经元，少突胶质细胞轴突/共培养神经胶质细胞车厢。从1-2日龄Sprague - Dawley大鼠大脑半球的解剖，少突胶质细胞，被添加到每个轴突/神经胶质细胞的车厢，在¹⁰⁰⁰个细胞/平方毫米的面积密度。装载细胞之前，约60％的车厢内的文化传媒与吸管吸气。必须注意不要触摸底部基板，因为它可能会损坏轴突在基板上形成的网络。然后，6700少突胶质细胞，在5μL培养基稀释，添加到轴突/神经胶质细胞车厢。细胞孵育1小时，车厢内都充满了文化传媒。
5. 细胞培养在37℃饱和湿度5％的CO ₂培养箱中，只有一半是文化传媒改变每隔3-4天，两个星期中的C。

第5部分：代表性的成果：

当实验进行正确，加载到SOMA车厢神经细胞定位密切微进水口和轴突层开始后1周的文化，形成轴突/神经胶质细胞车厢内。登录SOMA车厢内的神经细胞聚集，可以是一个迹象，细胞并不健康。当装载少突胶质细胞神经​​元文化的两个星期后应覆盖一层致密的轴突和少突胶质细胞，轴突/神经胶质细胞车厢应轴突层的顶部装上。

图1。示意图插图的高通量微流体多室中枢神经系统神经元共培养平台。剖视图显示从神经元胞体和树突，以及流体分钟流体水平的差异车厢之间的隔离的轴突隔离。请点击这里看到图1的放大版本。

图2多舱的制造和装配步骤的PDMS微流体合作文化设备。每个设备都适合到一个传统的6孔聚苯乙烯细胞培养板。请点击这里看大图图2。

Discussion

我们已经开发出一个多车厢文化合作平台，为研究哺乳动物中枢神经系统轴突的神经胶质细胞相互作用。中枢神经系统轴突被成功分离，从神经细胞团体/树突和少突胶质细胞内的设备已成功合作培养。神经元密度可以是多种多样的应用程序，但浓度过低或过高，可导致细胞死亡。此外，重要的是改变培养基的只有一半，在基板上，使细胞或轴索层不被损坏。我们预计，该系统将会为研究中枢神经系统轴突的神经胶质细胞在体外的信号网络的功能强大的工具，并提供路径朝着高通量筛选生长因子或潜在的候选药物，促进髓鞘和髓鞘修复平台。