Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Summary

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Abstract

Nós apresentamos um romance compartimento multi-plataforma neurônio microssistema co-cultura no SNC vitro de pesquisa interação axônio glia, capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo para um maior rendimento. Nós desenvolvemos um método de fabricação para criar novos dispositivos microfluídicos ter estruturas escala micro e macro dentro do mesmo dispositivo através de um processo de litografia suave único, permitindo a fabricação em massa, com boa repetibilidade.

O compartimento de multi-plataforma de co-cultura microfluídicos é composto por um compartimento de soma para os neurônios e seis axônio / glia compartimentos para oligodendrócitos (MQO). O compartimento de soma e axônio / glia compartimentos são conectados por matrizes de axônio-orientadores microcanais que funcionam como barreiras físicas para confinar soma neuronal no compartimento de soma, permitindo a crescer axônios em axônios / compartimentos glia. OLS carregado no axônio / glia compartimentos podem interagir apenas com os axônios, mas não com soma neuronal ou dendritos, permitindo localizada estudos axônio glia-interação. Os microcanais também permitiu o isolamento fluídico entre os compartimentos, permitindo seis experimentos independentes a serem realizados em um único dispositivo para um maior rendimento.

Litografia macia, usando poli (dimetilsiloxano) (PDMS) é uma técnica comumente usada em microdispositivos biomédica. Reservatórios nesses dispositivos são comumente definidos pela perfuração manual. Embora o alinhamento simples e pobre ea natureza demorada do processo faz com que este processo não é adequado quando um grande número de reservatórios tem que ser repetidamente criados. O método recém-desenvolvido não requerem perfuração manual de reservatórios, superar tais limitações. Em primeiro lugar, sete reservatórios (profundidade: 3,5 mm) foram feitas em um poli (metacrilato de metila) bloco (PMMA), usando uma máquina de moagem micro. Então, as matrizes de microestruturas cume, fabricados sobre um substrato de vidro, foram hot-relevo contra o bloco de PMMA para definir microcanais que conectam a soma e axônio / glia compartimentos. Esse processo resultou em macro-escala de reservatórios (3,5 mm) e micro-escala canais (2,5 mm) para coincidir dentro de um mestre único PMMA. Uma réplica PDMS que serviu como um mestre do molde foi obtido através de litografia suave, eo dispositivo PDMS final foi replicado a partir deste mestre.

Neurônios primários de E16-18 ratos foram carregados para o compartimento de soma e cultivadas por duas semanas. Após uma semana de cultura de células, os axônios cruzou microcanais e formou a camada de rede axonal somente dentro do axônio / glia compartimentos. Axônios cresceu de maneira uniforme ao longo de seis axônio / glia compartimentos e OLS de P1-2 ratos foram adicionados ao axônio / glia compartimentos de 14 dias in vitro para a co-cultura.

Protocol

Parte 1: Preparar um molde mestre para multi-compartimento neurônio fabricação de dispositivos de co-cultura

1. Primeiro passo para fabricar o mestre PMMA é fazer com que 3,5 milímetros de profundidade compartimentos. Um compartimento soma e seis axônio / glia compartimentos são definidos em um bloco de PMMA usando um micro-moagem de máquina (MDX-40, Roland ou qualquer outra máquina de fresagem CNC). PMMA mestre é, então, sonicado em álcool isopropílico por 10 minutos para remover detritos.
2. Matrizes de 2,5 mM estruturas crista alta são padronizados em um 50,8 mm x 50,8 mm por lâmina de vidro de um processo de fotolitografia padrão, seguido de corrosão úmida do vidro.
   Primeiro, matriz de estruturas cume são padronizados em um substrato de vidro limpo com fotorresiste positivo S1818 usando fotolitografia. S1818 é spin-revestido sobre o substrato (4000 rpm), macio com base em 110 ° C por 5 min, em seguida, exposto à luz UV (84 mJ / cm ²⁾ usando um alinhador de máscara seguido pelo desenvolvimento do fotorresiste em MF319 para 40 segundos. Em seguida, o fotorresiste substrato de vidro modelado é imerso em óxido de buffer etch (BOE) em temperatura ambiente por 6-7 minutos para obter um 2,5 mM estruturas cume de altura. Finalmente, a camada de fotorresiste é retirado por acetona e álcool isopropílico, seguido de uma lavagem completa em água desionizada (DI).
3. Substrato de vidro com micro-ridge estruturas é hot-relevo contra o capitão PMMA para transferir seus padrões.
   Primeiro, PMMA mestre molde e substratos de vidro são alinhados manualmente e colocadas em uma prensa quente. Então, a temperatura é elevada a 115 ° C. Quando a temperatura desejada é atingida, 0,5 toneladas de peso é aplicado por 5 minutos. Após 5 minutos, a temperatura é resfriado a 40 ° C ea pressão é liberada. O mestre PMMA é então cortado em 50,8 mm x 50,8 bloco de tamanho mm.
4. PDMS pré-polímero (Sylgard 184) é misturado com agente de cura na proporção de 10: 1 em peso.
5. PMMA mestre é colocado dentro de um barril e mistura PDMS é derramado em cima do mestre de PMMA para fabricar um mestre PDMS. Em seguida é colocado em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo. PDMS derramado em cima da PMMA mestre é, então, desgaseificados por 15 minutos para remover as bolhas geradas durante o processo de PDMS mistura.
6. Quando todas as bolhas são removidas, PDMS é colocado dentro de um forno de 85 ° C nivelado por uma hora para a polimerização.
7. Uma vez PDMS é completamente curado, PDMS mestre é retirado do mestre PMMA e colocado dentro de um dessecador com 2-3 gotas de triclorosilano e aspirado por 15 minutos para vapor revestimento do PDMS superfície master. Revestimento triclorosilano facilita a liberação da final PDMS neurônio co-cultura dispositivos do mestre PDMS. Após o revestimento, o mestre PDMS é brevemente lavados com álcool isopropílico para remover triclorosilano excessiva, e secos com gás N _2.

Parte 2: Neuron replicação dispositivo de cultura

1. PDMS pré-polímero (Sylgard 184) é misturado com agente de cura na proporção de 10: 1 em peso.
2. Mistura PDMS é derramado em cima do mestre PDMS e desgaseificado dentro de um dessecador conectado a uma bomba de vácuo por 15 minutos. É importante para não derramar PDMS muito para que os 3,5 milímetros estrutura PDMS alta no mestre não está totalmente imerso.
3. Quando todas as bolhas são removidas, PDMS é colocado dentro de um forno de 85 ° C nivelado por uma hora para a polimerização.
4. PDMS é retirado do forno após uma hora e à temperatura ambiente para esfriar. Então, os dispositivos cultura PDMS neurônio são gentilmente tirou do mestre PDMS. Descascada dispositivos PDMS são embrulhados com parafilme para protegê-los de poeiras ou detritos.
5. PDMS dispositivos, envolvido com parafilme, são cortadas em pedaços individuais usando uma furadeira equipada com uma lâmina.

Parte 3: Dispositivos de montagem

1. PDMS dispositivo cultura neurônio é colocado dentro do limpador de plasma e exposta ao ar plasma por 90 segundos para fazer a superfície do dispositivo PDMS hidrofílico. Este tratamento plasma facilitará microcanais para ser preenchido com meios de cultura após a montagem de poli-d-lisina substrato revestido.
2. Dispositivos tratados com plasma são, então, imersas em etanol 70% por 30 minutos para esterilização e mudou-se dentro do esterilizados bio-capa.
3. Dispositivos esterilizados são retirados a partir do etanol 70% e secos com Millipore filtrada N ₂ gás. Dispositivos secas são colocadas em cima de poli-d-lisina de isopor revestido de 6 bem placa de cultura e de uma leve pressão é aplicada para garantir a vedação entre o substrato eo dispositivo.
4. Cultura da mídia é então preenchido no compartimento de soma, seguido de preenchimento dos seis axônio / glia compartimentos. É melhor dar uma pausa de 1-2 minutos antes de encher axônio / glia compartimentos após a adição de meios de cultura para o compartimento soma para garantir que não haja bolhas dentro dos microcanais.
5. Dispositivos cheio de meios de cultura é incubado dentro de uma incubadora de 37 ° C durante a noite para lavar todos os detritos possíveis ou resíduos tóxicos.

Parte 4: Carregamento da célula e neurônio-oligodendrócitos co-cultura

1. No primeiro dia da cultura de células, células primárias de neurônios do prosencéfalo embrionário do dia 16-18 ratos são carregados no compartimento soma a uma densidade de 500 células / mm ^2. Em primeiro lugar, meios de cultura tanto dentro do compartimento de soma e axônio / glia compartimentos são aspirados com pipeta antes de carregar celular. Então, as células 38.500, diluído em 40 mL de meios de cultura, são carregados para o compartimento de soma em torno das entradas de microcanais. É importante não tocar o dispositivo PDMS ao carregar as células, uma vez que pode quebrar o selo entre o dispositivo eo substrato.
2. Incubar os dispositivos celulares carregados por 30 minutos dentro de uma incubadora de 37 ° C para melhorar a adesão celular ao substrato. Após a incubação, todos os compartimentos são enchidos com meios de cultura.
3. As células são cultivadas a 37 ° C em um umidificado 5% incubadora de CO ₂ e apenas metade de meios de cultura é trocado a cada 3-4 dias.
4. Após 14 dias de cultura in vitro de neurônios, oligodendrócitos são adicionados aos compartimentos axônio / glia para co-cultura. Oligodendrócitos, dissecados dos hemisférios cerebrais de ratos Sprague-Dawley em dia pós-natal 1-2, são adicionados a cada compartimento axônio / glia em uma densidade de área de 1.000 células / mm ^2. Antes de células de carga, aproximadamente 60% dos meios de cultura no interior dos compartimentos são aspirados com pipeta. O cuidado deve ser feita para não tocar o substrato de fundo, pois pode danificar a rede axonal formada sobre o substrato. Então, 6700 células oligodendrócitos, diluído em 5 mL de meios de cultura, são adicionados aos compartimentos axônio / glia. As células são incubadas por 1 hora e compartimentos são enchidos com meios de cultura.
5. As células são cultivadas a 37 ° C em um umidificado 5% incubadora de CO ₂ e apenas metade de meios de cultura é trocado a cada 3-4 dias por mais duas semanas.

Parte 5: Resultados Representante:

Quando os experimentos são realizados corretamente, células neuronais carregada para o compartimento soma localizar perto de entradas de microcanais e camada axonal começam a se formar no interior dos compartimentos axônio / glia, após uma semana de cultura. Sinal de neurônio a agregação de células no interior do compartimento soma pode ser uma indicação de que as células não são saudáveis. Ao carregar oligodendrócitos após duas semanas de cultura neurônio, axônio / glia compartimentos devem ser cobertos com densa camada de axônios e oligodendrócitos deve ser carregado em cima da camada de axonal.

Figura 1. Ilustrações esquemático do compartimento multi-microfluídicos CNS high-throughput neurônio plataforma de co-cultura. Transversal vista mostrando o isolamento de axônios do soma neuronal e dendritos, assim como o isolamento fluídico entre os compartimentos com diferença de nível fluídico minutos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.

Figura 2. Fabricação e etapas de montagem para o compartimento multi-PDMS microfluídicos dispositivo de co-cultura. Cada dispositivo se encaixa em um poço de uma 6-bem placa de poliestireno convencional de cultura celular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Discussion

Nós desenvolvemos um compartimento multi-plataforma de co-cultura para estudar mamíferos CNS interação glia-axônio. Axônios do SNC foram isoladas com sucesso a partir de células neuronais corpos / dendrites, e oligodendrócitos foram co-cultivados com sucesso dentro do dispositivo. Densidade de neurônios pode ser variada por aplicativos, mas a concentração muito baixa ou muito alta pode levar as células à morte. Além disso, é importante mudar apenas metade de meios de cultura para que as células ou camada axonal sobre o substrato não estão danificados. Esperamos que este sistema será uma ferramenta poderosa para estudar CNS axônio glia de sinalização redes in vitro e oferecer um caminho em direção a uma plataforma high-throughput screening para fatores de crescimento ou potenciais medicamentos que promovem a mielinização e reparação de mielina.