ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Summary

Un protocollo per rilevare tricoteceni (micotossine di preoccupazione per la salute umana), utilizzando un metodo di screening di nuova concezione basata su un metodo competitivo immunochimici e una rilevazione finale elettrochimica è dimostrata.

Abstract

Immunologici sono una valida alternativa al più costoso e richiede tempo quantitativa HPLC o GC ^{1, 2} metodi di screening per la rilevazione di micotossine pericolose nei prodotti alimentari. In questo protocollo si mostra come fabbricare e interrogare un enzima competitivo elettrochimica alla prova di immunomagnetica basato sull'uso di sfere magnetiche come supporto solido per la catena di immunochimica ³ e elettrodi serigrafati come piattaforma di rilevamento.

Il nostro metodo mira a determinare la quantità totale di HT-2 e tossine T-2, micotossine appartenente alla famiglia tricoteceni e di grande preoccupazione per la salute umana ^4. L'uso di un clone di anticorpo con una reattività incrociata del 100% verso HT-2 e T-2 consente di rilevare simultaneamente sia le tossine con sensibilità simili ^5.

Il primo passo della nostra analisi è la fase di rivestimento in cui si immobilizzare HT2-KLH tossina coniugato sulla superficie di sfere magnetiche. Dopo una fase di blocco, necessario per evitare assorbimenti non specifici, l'aggiunta di un anticorpo monoclonale permette la competizione tra immobilizzato HT-2 e liberi presenti HT-2 o T-2 nel campione o disciolte in una soluzione standard.

Al termine della fase di concorso, la quantità di anticorpo monoclonale legato alla immobilizzato HT-2 sarà inversamente proporzionale alla quantità di tossina nella soluzione campione.

Un anticorpo secondario marcato con fosfatasi alcalina (AP) è usato per rivelare il legame tra l'anticorpo specifico e la immobilizzato HT-2. Il passo finale di misurazione viene eseguita lasciando cadere una aliquota di sospensione magnetica tallone, corrispondente ad uno specifico campione / soluzione standard, sulla superficie di uno schermo-stampa dell'elettrodo di lavoro; sfere magnetiche sono immobilizzati e concentrato per mezzo di un magnete posizionato proprio sotto l' serigrafato elettrodo. Dopo due minuti di incubazione tra sfere magnetiche e un substrato per AP, il prodotto enzimatico viene rilevato da Voltammetria Differential Pulse (DPV) utilizzando uno strumento portatile (PalmSens) anche in grado di avviare automaticamente otto misure in un intervallo di pochi secondi.

Protocol

1) Il blocco rivestito sfere magnetiche:

Procedere come segue per bloccare patinata sfere magnetiche:

1. Preparare una serie di tubi Eppendorf da 2 ml;
2. Omogeneizzare (agitazione, ma non vortex) rivestito sfere magnetiche (si veda l'appendice per la preparazione di carta patinata sfere magnetiche) con il campione di rotazione mixer;
3. Immediatamente dopo omogeneizzazione, pipettare 10 ml di rivestimento sfere magnetiche in ogni tubi separati Eppendorf;
4. Aggiungere 1 ml di latte scremato blocco soluzione in ciascuna provetta Eppendorf del set;
5. Lasciate sfere magnetiche incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sul mixer campione rotante;
6. Rimuovere il blocco soluzione: farlo posto il tubo di concentratore di particelle magnetiche con la parte magnetica messo su per 2 min (vedere sfere magnetiche attaccare sulla parete laterale del tubo); pipetta con attenzione il sopranatante, lasciando indisturbato perline;
7. Aggiungere 1 ml di tampone PBS + NaN ₃ + BSA come soluzione di storage per ogni tubo;
8. Conservare patinata e bloccato sfere magnetiche a 4 ° C (si noti che rivestiti sfere magnetiche sono stabili per almeno 2 mesi a 4 ° C);

2) catena immunologici su sfere magnetiche per la costruzione della curva di calibrazione e analisi dei campioni

Procedere come segue per avere sfere magnetiche pronte per la misura:

1. Prendete un tubo Eppendorf (2 ml) di soluzione rivestito e bloccati per ogni campione che si sta per analizzare;
2. Prendete un tubo Eppendorf in più per ogni soluzione calibrante di lavoro;
3. Omogeneizzare sfere magnetiche per 2 minuti sul mixer campione rotanti prima dell'uso;
4. Rimuovere il liquido di storage utilizzando concentratore magnetico delle particelle;
5. Lavare le sfere magnetiche tre volte con PBS / BSA soluzione di lavaggio. Rimuovere il liquido di lavaggio;
6. Passo concorso: Aggiungere per ogni tubo contenente le sfere magnetiche lavate, 200μl di campione preparato, utilizzare un tubo perla magnetica per ogni campione. Ripetete la stessa procedura per ogni soluzione standard. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di anticorpo monoclonale ad ogni provetta perla magnetica. Lasciate sfere magnetiche incubare per mezz'ora sul mixer campione rotante a temperatura ambiente;
7. Rimuovere dai tubi Eppendorf la soluzione utilizzata per la concorrenza-passo;
8. Etichettatura passo: Aggiungere 400μl di anticorpo secondario ad ogni magnetico tubo Eppendorf tallone. Lasciate sfere magnetiche incubare per mezz'ora sul mixer campione rotante a temperatura ambiente;
9. Rimuovere l'etichettatura soluzione da tubi Eppendorf;
10. Lavare le sfere magnetiche tre volte con PBS / Tween ® 20 soluzione di lavaggio. Asportare il liquido;
11. Risospendere con 100μl di tampone DEA ciascuna aliquota di sfere magnetiche. Ora le sfere magnetiche sono pronti per il passo di misura elettrochimica;

3) Assemblea dei PalmSens con Multiplexer (Mux) Opzioni

Si prega di notare: prodotto di idrolisi enzimatica del substrato falli la superficie dell'elettrodo, per questo motivo un nuovo elettrodo è necessario per ogni misurazione.

1. Collegare un PC portatile per PalmSens attraverso il cavo seriale;
2. Collegare il 9-connettore DIN di CH8 Multiplexer con PalmSens.
3. Collegare il cavo seriale del canale Mux Otto contatto elettrico con CH8 Multiplexer;
4. Luogo striscia elettrodo sul blocco magnete otto. Prestare attenzione al luogo in ogni magnete sotto ogni elettrodi di lavoro (di nota, la necessità di un magnete unico per ogni elettrodo è indispensabile altrimenti la particella magnetica non sarà concentrata sulla superficie degli elettrodi di lavoro);
5. Collegare striscia elettrodi in otto contatto canale Mux elettrici;

Per la misurazione DPV utilizzare i seguenti parametri nelle caselle appropriate:
E comincia: 0 (V); fine E: 0,6 (V); passo E: 0,016 (V); E impulso: 0,0339 (V); E condizionata: Velocità di scansione;:: 0 (V) 0 (V) E deposizione : 0,1 (V / s); T impulso: 0,06 (s); condizionata T: 0 (s); deposizione T: 0 (s); equilibrio T: 8 (s).

4) reazione enzimatica ed elettrochimica di misura

1. Omogeneizzare agitando delicatamente ogni tubo Eppendorf contenente microsfere magnetiche pronte per il passo di misura elettrochimiche in modo da ottenere una sospensione e dispersi di grani magnetici;
2. Pipetta da ogni Eppendorf, subito dopo omogeneizzazione, una aliquota di 20 microlitri della dispersione magnetica tallone sulla superficie dell'elettrodo di lavoro corrispondente. Per ogni elettrodo di un uso striscia 20 l di sfere magnetiche presi da diverse provette Eppendorf (ad esempio l'uso di elettrodi per otto otto diversi Eppendorf);
3. Aggiungere 80 ml di soluzione di substrato enzimatico sul primo elettrodo. Start 2 min il conto alla rovescia. Dopo 14 secondi, aggiungere 80 ml di soluzione di substrato enzimatico sul secondo elettrodo. Dopo altri 14 secondi, aggiungere 80 ml di soluzione di substrato enzimatico sul terzo elettrodo. Procedere al tempo stesso interval (14 secondi) fino all'ultimo l'elettrodo (che significa: ogni goccia aliquota del substrato con intervalli di 14 sec). L'intervallo di tempo di 14 sec è calcolato come il tempo richiesto dalla potenziostato per eseguire la misura; di nota, le 80 ul di soluzione per ogni sensore dovrebbe coprire l'elettrodo di lavoro di riferimento e contatore. Inoltre, le soluzioni per ogni sensore non deve venire in contatto con le soluzioni di elettrodi vicini.
4. Dopo il conto alla rovescia 2 min dalla prima aggiunta della soluzione di substrato enzimatico, avviare la misurazione elettrochimica;
5. Utilizzare il PalmSens Lite software per ottenere i picchi di corrente (mA) per ogni soluzione.

5) Calcolo

Costruire una curva di calibrazione utilizzando una equazione logistica 4 parametri e calcolare la concentrazione del totale HT-2/T-2 quantità di tossine in nanogrammi per millilitro per ogni tubo Eppendorf contenente campione incognito.

I dati sperimentali, altezza del picco (mA) contro la concentrazione dei calibratori (ng / ml), devono essere montati con un non-lineare a quattro parametri logistici (4-PL) plot equazione (1) (utilizzando Plot Sigma 8.0 o Kaleidagraph). Il non lineare 4-PL modello è di solito adottato per descrivere ligando saggi vincolanti (LBA) ^6.

(1)
a, b, x0, y0 sono parametri logistici come indicato dal programma Sigma Plot forma curva.
Utilizzare la formula per calcolare esplicitato il contenuto di tossina HT-2/T-2 quantità totale presente nella soluzione diluita campione
(2)
x è la concentrazione di massa della quantità totale di HT-2/T-2 tossine nella soluzione di estratto diluito, calcolato dalla equazione logistica 4 parametri in nanogrammi per milliltre (ng / ml)
y è il valore corrente in μA ottenuti per il campione sconosciuto

Appendice

6) rivestito sfere magnetiche

Procedere come segue per avere rivestito sfere magnetiche:

Procedura di lavaggio

1. Omogeneizzare Dynabeads tosylactivated ® M-280 (magazzino soluzione 2 x 109 perline / ml), agitando e vortex (velocità max) per 1 min (evitare la formazione di schiuma) (notare la concentrazione di sfere magnetiche deve essere sempre lo stesso per garantire la riproducibilità in la misura);
2. Immediatamente pipetta 1 ml di perline sopra omogeneizzato in una provetta Eppendorf da 2 ml;
3. Porre il tubo in concentratore di particelle magnetiche con la parte magnetica messo su per 2 min (vedere sfere magnetiche attaccare sulla parete laterale del tubo);
4. Con attenzione pipetta il sopranatante, lasciando indisturbato perline;
5. Togliere la provetta Eppendorf da concentratore di particelle magnetiche e risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M tampone borato pH 9.5. Mescolare delicatamente per 2 minuti nel mixer campione rotante per 2 minuti;
6. Pipetta il sopranatante;
7. Pipettare 1 ml di soluzione tampone borato nel tubo Eppendorf. Biglie magnetiche sono ora pronti per la fase di rivestimento;

Procedura di rivestimento

8. Aggiungere 600 ml di HT-2, coniugato con KLH (Keyhole Hemocyanin Patella), soluzione madre di 1 ml di perline magnetiche) (finale HT-2-KLH concentrazione di 375 mg / ml); incubare sfere magnetiche e HT-2-KLH soluzione per 20h a 37 ° C * con rotazione lenta inclinazione sulla rotazione mixer campione;
9. Dopo luogo di incubazione del tubo nel concentratore di particelle magnetiche e pipetta il sopranatante;
   Lavare perline ricoperto due volte con 1 ml di PBS / BSA soluzione tampone. Tra ogni lavaggio rimuovere PBS / BSA soluzione. Tutti fase di lavaggio sono state effettuate impostando sfere magnetiche e PBS / BSA in un miscelatore rotante per 5 minuti;
10. Lavare sfere magnetiche, una volta con 1 ml di TRIS / BSA soluzione tampone. Rimuovere TRIS / soluzione BSA. Effettuare questa operazione impostando sfere magnetiche e TRIS / BSA tampone sulla rotazione mixer per 4 ore a 37 ° C *;
11. Lavare sfere magnetiche, una volta con 1 ml di aggiornare (conservato in frigorifero a 4 ° C) PBS / BSA soluzione tampone. Rimuovere PBS / BSA soluzione. Eseguire questo passo impostazione sfere magnetiche e PBS / BSA tampone sulla rotazione mixer per 5 minuti a temperatura ambiente;
12. Dopo il lavaggio passo rimuovere tutto il liquido di lavaggio e aggiungere 1 ml di tampone PBS + NaN ₃ + BSA come liquido di stoccaggio;
13. Conservare rivestito sfere magnetiche a 4 ° C (si noti che rivestiti sfere magnetiche sono stabili per almeno 2 mesi a 4 ° C);

* A tal fine il miscelatore è posto in forno dotato di un foro che permette l'inserimento del cavo per l'alimentazione. In alternativa, il mixer può essere inserito in una camera termostatata a 37 ° C.

7) Preparazione dei campioni e l'estrazione

25 g di campione macinato finemente (per bambini cereali alimentari o prima colazione) siamoighed in un vaso frullatore ed estratti con 100 ml di acetonitrile / soluzione acquosa (86/14) per 3 minuti in un frullatore ad alta velocità. Dopo centrifugazione a 4000 giri (3000 g) per 5 minuti, 8 ml di surnatante sono state prese e purificata con colonna Mycosep, 4 ml di estratto sono stati puliti essiccato sotto flusso di azoto. Campioni essiccati possono essere conservati a -30 ° C fino a diversi mesi.

8) la ricostituzione del campione

Cereali per la colazione

Ricostituire l'estratto secco di cereali prima colazione (alimentari a base di cereali destinati al consumo degli adulti) con 40 ml di PBS pH 7,4. In questo modo, un campione con una concentrazione di tossina pari al limite legale supposta (200 ng / g), si cede il passo misura un segnale cade nel mezzo del campo di lavoro.

Alimenti per bambini

Ricostituire il cibo secco estratto per l'infanzia (alimenti a base di cereali destinati al consumo infantile) con 4 ml di PBS. In questo modo, un campione con una concentrazione di tossine pari al limite legale presunta (20-25 ng / g), si cede il passo misura un segnale cade nel mezzo del campo di lavoro.

Discussion

L'uso di anticorpi come sonde biomolecolari riconoscimento ha visto un ampio utilizzo di tecnologie di rilevamento, metodologie di rilevazione immunochimica, quali ELISA e MEIAs, sono, al giorno d'oggi, tra le piattaforme più utilizzate e applicate in molti laboratori ^7.

Anche se questi approcci raggiungere una sensibilità eccezionale e specificità, un obiettivo primario di molti gruppi di ricerca negli ultimi anni è stato il miglioramento e l'ottimizzazione delle loro prestazioni.

In questo protocollo abbiamo mostrato come fabbricare e interrogare un immunosensor elettrochimica per la rilevazione di micotossine. Crediamo che l'uso di elettrochimica per sviluppare immuno-sensori basati si rivelerà sempre più importante in futuro. Ciò è dovuto ai vantaggi intrinseci di rilevazione elettrochimica oltre quello ottico. Elettrochimica è infatti meno soggetto a interferenze e si è dimostrato straordinariamente robusta contro i non-specifica di adsorbimento e buone prestazioni anche se contestata in matrici di campioni complessi, come cereali per la colazione e la pappa. Inoltre, l'elettrochimica è più adatto alla miniaturizzazione e di multi-array di adattamento.

L'accoppiamento di tale approccio con nanoparticelle magnetiche hanno anche migliorato le prestazioni analitiche e hanno dimostrato di essere particolarmente adatto per il rilevamento di contaminanti nei campioni alimentari.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.